薛淑群，王星然，李池陶，賈智英，韓英，石連玉

（1.中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.東北農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

三倍體魚生長快、肉質(zhì)好、抗逆性強、不干擾環(huán)境和其他魚類資源，具有重要的研究價值和廣闊的應用前景[1]。

目前多采用溫度休克、靜水壓力休克等物理學方法誘導三倍體魚類，并在虹鱒Oncorhynchus mykiss、彩鯽Carassius auratus、鯉Cyprinus carpio 等多種養(yǎng)殖魚類中獲得成功[2]。但這兩種誘導技術尚不夠完善，誘導中受精卵壞死率高、出苗率低、幼魚畸形高影響了三倍體產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展。目前魚類三倍體的研究大多集中在誘導技術、性激素水平、營養(yǎng)組成、性腺發(fā)育等方面[3]，誘導過程中，外界脅迫對受精卵和胚胎發(fā)育的影響尚未見報道。本實驗以松浦鏡鯉優(yōu)質(zhì)受精卵作為研究對象，通過對胚胎亞顯微結構的比較，研究三倍體制種方法對受精卵和胚胎是否有誘導損傷、損傷程度及其對胚胎發(fā)育的影響，旨在為完善魚類三倍體制種技術提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

繁殖用松浦鏡鯉親魚飼養(yǎng)于黑龍江水產(chǎn)研究所淡水魚繁育中心，人工催產(chǎn)，干法授精，23～25 ℃水中授精和孵化。

冷休克誘導：人工受精4 min 后，將受精卵轉(zhuǎn)移到0～2 ℃的冰水中，冷休克脅迫15 min，然后置于23～25 ℃水中孵化[4]。

靜水壓力誘導：將受精卵撒在細目篩網(wǎng)上4 min 后，迅速折疊篩網(wǎng)放入600 kg/cm2壓力的靜水壓力器中，持續(xù)處理3 min 后，取出篩網(wǎng)于23～25 ℃的水中繼續(xù)孵化[5]。

對照組：同批受精卵在23～25 ℃的水中孵化，與誘導組同期取樣，做同樣分析。

1.2 方法

每組計數(shù)100 個受精卵的孵化出膜的魚苗數(shù)量，計算孵化率=出膜苗數(shù)/孵化卵數(shù)×100%；每組觀察100 尾仔魚，每24 h 記錄仔魚的畸形和死亡情況，計算仔魚畸形率，連續(xù)7d，統(tǒng)計仔魚死亡率。

鯉胚胎的透射電鏡切片按下述方法制作：每組取10 粒經(jīng)2.5%戊二醛中固定的受精卵，抽去受精卵周圍多余空氣，使受精卵下沉，固定一周后取出。用pH7.2 的鹽酸緩沖溶液反復沖洗，每次15 min，至少三次。置于2%的鋨酸固定液再次固定1.5 h后。用pH7.2 的鹽酸緩沖液多次沖洗，每次15 min，至少三次。上升梯度的酒精脫水。用體積比1∶1 的丙酮與乙醇混合溶液進行置換。Epon812 包埋劑進行包埋。超薄切片機切片，切片厚度為50 nm。將薄片固定在銅網(wǎng)上，常溫下用醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛對薄片進行染色。雙蒸水沖去多余染液，晾干。

鯉胚胎的超微組織結構在透射電子顯微鏡下觀察。

2 結果與分析

2.1 鯉受精卵孵化及胚胎發(fā)育觀察

對照組、冷休克組、靜水壓組的受精卵孵化率見表1，3 個組受精卵的孵化率分別為76%、51%和39%。

由表1 可知，冷休克組畸形率為15%，死亡率為10%；靜水壓組畸形率為23%，死亡率為17%。

表1 各實驗組鯉受精卵的孵化率和仔魚畸形率和死亡率Tab.1 Hatching rate of fertilized eggs,and larval abnormal rate and mortality in common carp in each group

2.2 鯉胚胎組織超微結構觀察

2.2.1 誘導后3 min 組（圖1）

與對照組相比（圖1-1），冷休克誘導組胚胎線粒體表面結構完整光滑，略有褶皺，內(nèi)部呈不均一性變化，線粒體嵴有序結構受到輕微破壞，嵴的高度和半高寬坡度沒有明顯變化。核糖體排列呈密集趨勢（圖1-2）。

與對照組（圖1-1）相比，靜水壓力組結構改變明顯，線粒體表面結構完整，出現(xiàn)褶皺和明顯塌陷，內(nèi)部呈不均一性變化；線粒體嵴有序結構受到破壞，出現(xiàn)輕微囊泡化現(xiàn)象；核糖體排列密集（圖1-3）。

2.2.2 誘導后20 min 組（圖2）

與對照組（圖2-1）相比，冷休克組鯉胚胎線粒體表面褶皺明顯，內(nèi)部呈不均一性變化;線粒體嵴有序結構受到破壞，線粒體嵴分裂出現(xiàn)輕微囊泡化現(xiàn)象，被破壞的線粒體比例增大，線粒體膜塌陷，無明顯腫脹趨勢。核糖體排列密集（圖2-2）。

與對照組（圖2-1）相比，靜水壓組鯉胚胎損傷明顯：線粒體嵴結構被嚴重破壞，嵴變少甚至消失，大面積囊泡化，細胞損傷尤為明顯，被破壞的線粒體比例增大，幾乎不存在完整結構的線粒體。核糖體排列異常密集（圖2-3）。

2.2.3 誘導后45 min 受精卵細胞質(zhì)亞顯微結構（圖3）

與對照組（圖3-1）相比，冷休克組鯉胚胎細胞器狀態(tài)開始逐漸好轉(zhuǎn)，一些線粒體的嵴結構逐漸恢復，線粒體膨脹向球形變化，表面重新變得光滑平整；核糖體排列密集（圖3-2）。

靜水壓組鯉胚胎的線粒體嵴結構開始逐漸恢復，空泡化的線粒體依舊存在，線粒體表面重新變得光滑平整，核糖體排列密集（圖3-3）。

2.2.4 誘導后120 min 組（圖4）

與對照組（圖4-1）相比，冷休克組鯉胚胎線粒體的嵴結構開始逐漸恢復，線粒體表面光滑平整，嵴有序結構恢復正常，細胞器排列與對照組無顯著性差異（圖4-2）。

與對照組（圖4-1）相比，靜水壓組鯉胚胎細胞器形態(tài)繼續(xù)好轉(zhuǎn)，線粒體的嵴有序結構逐漸恢復，線粒體表面光滑平整，細胞器形態(tài)逐漸完整，細胞器排列依舊比較集中，核糖體相對致密（圖4-3）。

2.2.5 誘導后24 h 組（圖5）

相對于對照組（圖5-1），靜水壓與冷休克脅迫組鯉胚胎細胞器形態(tài)與對照組沒有差別，線粒體上存在比較完整的內(nèi)膜結構，細胞器排列不再致密（圖5-2 和圖5-3）。

靜水壓與冷休克脅迫組鯉胚胎的細胞器形態(tài)與對照組（圖6-1）沒有差別，線粒體表面重新變得光滑平整，嵴結構有序，細胞器排列與對照組無異（圖6-2 和圖6-3）。

3 討論

在23～25 ℃水溫下，鯉卵受精后4～5 min 處于第二次有絲分裂期。此期對外界環(huán)境脅迫十分敏感，一定的環(huán)境脅迫會使微管蛋白解聚，紡錘體消失，第二極體不能排出[6,7]。脅迫撤去，有絲分裂最終會完成，但由于第二極體的排出，使染色體組三倍化[8]。多采用冷休克與靜水壓方法誘導魚類的染色體組三倍化，此過程中，受精卵壞死率高、出苗率低、幼魚畸形等問題[9]，染色體組三倍化誘導方法對受精卵內(nèi)胚胎發(fā)育的影響未見報道，對這一現(xiàn)象產(chǎn)生的機制研究呈現(xiàn)空白，不利于完善三倍化誘導技術。

本研究中，對照組受精卵孵化率76%，冷休克組和靜水壓組的受精卵分別孵化率為51%和39%；仔魚畸形率為15%和23%；死亡率10%和17%。誘導魚染色體三倍化過程中，采用冷休克和靜水壓誘導均會出現(xiàn)孵化率降低、仔魚畸形率和死亡率高的現(xiàn)象，靜水壓組的孵化率更低、仔魚畸形率和死亡率最高，靜水壓脅迫對受精卵和胚胎發(fā)育的負面影響更顯著。

透射電子顯微觀察到：誘導后3～20 min，誘導組胚胎線粒體等細胞器受損嚴重，線粒體的內(nèi)膜與嵴結構也受到不同程度的破壞，其中靜水壓組更為嚴重，細胞器空泡化，核糖體異常致密。45 min 后這一現(xiàn)象開始逐漸好轉(zhuǎn)，冷休克與靜水壓組細胞器形態(tài)逐漸好轉(zhuǎn)，45～120 min 誘導組胚胎細胞器損傷水平開始逐漸恢復，空泡化細胞器大量減少，逐漸出現(xiàn)完整結構的線粒體，靜水壓脅迫組核糖體仍稍顯致密；24～48 h 時，誘導組細胞器損傷已經(jīng)基本恢復，與對照組相比，冷休克與靜水壓組細胞器形態(tài)、數(shù)量基本無差異。

吳勤超[10]誘導黃顙魚多倍體時發(fā)現(xiàn)：靜水壓、冷休克處理組均會產(chǎn)生畸形胚胎，靜水壓組的畸形率要高于別的處理組。本研究中也觀察到了相似現(xiàn)象。冷休克與靜水壓處理組比，處理強度要溫和一些，破壞相對少一些，靜水壓誘導施加的瞬時外力對受精卵的破壞更難恢復。從線粒體以及其他細胞器形態(tài)上看，直到受精后48 h，靜水壓組才與對照組無顯著性差異，而冷休克組在24 h 時就已經(jīng)顯示出完整的細胞器形態(tài)。以上現(xiàn)象表明，脅迫誘導對胚胎超微結構造成了一定的影響，在一定時間內(nèi)，冷休克與靜水壓脅迫細胞器的損傷會逐漸恢復，靜水壓脅迫對胚胎發(fā)育影響更為顯著。

在冷休克與靜水壓脅迫下，胚胎的蛋白構象被破壞，部分蛋白失活、變性，蛋白復合體也會受到損傷，生物活性降低甚至失活。機體為了應對這種脅迫，需要產(chǎn)生應激蛋白，以幫助受損的蛋白恢復構象與活性，幫助失活的蛋白降解以及新蛋白的合成裝配[11]。受精卵會消耗部分胚胎發(fā)育的能量用于自身受損修復，影響正常發(fā)育，這可能是誘導三倍體過程中孵化率偏低的重要原因[12]。冷休克對胚胎的損傷更溫和，更容易恢復，靜水壓誘導施加的瞬時外力會對誘導起到很好的效果，靜水壓誘導魚染色體三倍化是目前誘導率最高的方法，但這也會對受精卵造成更難恢復的破壞[13]，相對與冷休克溫差的變化，壓力脅迫更為劇烈，也更難以恢復。在一定時間內(nèi)，冷休克與靜水壓脅迫對細胞器的損傷會逐漸恢復，靜水壓脅迫對胚胎發(fā)育影響更為顯著。吳勤超發(fā)現(xiàn)，靜水壓誘導會得到更低的孵化率與更高的畸形率，因此，認為靜水壓會胚胎產(chǎn)生更大的破壞，這與本實驗結論一致。靜水壓誘導脅迫對受精卵的應激損傷大于冷休克，對受精卵和胚胎發(fā)育的負面影響更為顯著，需要更長的恢復期[14]。

本研究通過對胚胎亞顯微結構的比較，研究三倍體制種方法對受精卵和胚胎發(fā)育是否造成誘導損傷、損傷程度及其對胚胎發(fā)育的影響，旨在為魚類三倍體制種技術的完善提供理論依據(jù)。