賴雁威，劉麗娟，黃艷平，武敬**

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 藥學(xué)部, 廣東 深圳 518036； 2.羅湖區(qū)人民醫(yī)院 藥學(xué)部，廣東 深圳 518001)

慢性腹瀉病因復(fù)雜，涉及感染、過敏、免疫缺陷、先天畸形、酶缺陷、腸動(dòng)力缺陷等機(jī)制，在嬰幼兒中的發(fā)病率較高，對(duì)兒童生長發(fā)育危害較大[1]。臨床對(duì)慢性腹瀉病的治療多圍繞調(diào)節(jié)腸道分泌展開，常用抗腹瀉藥物包括洛哌丁胺、蒙脫石散等，兒童應(yīng)用蒙脫石散的安全性高，對(duì)消化系統(tǒng)內(nèi)病菌、細(xì)菌及毒素均有抑制作用，可保護(hù)消化道黏膜，提高黏膜屏障防御功能，目前廣泛應(yīng)用慢性腹瀉治療中，但也存在禁忌癥多，長期應(yīng)用可能引起便秘、腹脹等不良反應(yīng)[2-3]。大蒜素是從大蒜球莖分離的一種二烯丙基三硫化物，具有典型抗炎、抗氧化、抗真菌等的生物學(xué)活性，有研究報(bào)道，大蒜素對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎腸黏膜存在典型的保護(hù)作用[4]；也有試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)大蒜素可通過抑制Toll樣受體4(Toll like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，避免核因子激活，減輕心肌的炎癥反應(yīng)[5]。關(guān)于大蒜素對(duì)慢性腹瀉腸黏膜調(diào)節(jié)作用及對(duì)腸黏膜TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響未見報(bào)道，為探討大蒜素對(duì)慢性腹瀉的干預(yù)價(jià)值及可能機(jī)制，本研究對(duì)復(fù)制的慢性腹瀉大鼠模型給予大蒜素灌胃，并以空白組、模型組及蒙脫石散組作為對(duì)照，探究大蒜素對(duì)慢性腹瀉大鼠腸黏膜修復(fù)及腸黏膜TLR4/NF-κB信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性Wistar大鼠40只，4～5周齡，體質(zhì)量80～150 g，平均(110.7±10.5)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供[許可證號(hào)SCXK(滬)2018-0002]。大鼠統(tǒng)一獨(dú)立飼養(yǎng)，空氣潔凈度10 000級(jí)，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度60%，空氣交換次數(shù)10～15 次/h，光照周期明暗比為12 h ∶12 h，全價(jià)鼠顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水。

1.1.2主要藥物、試劑與儀器 大蒜素注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)、蒙脫石散(海南先聲藥業(yè)有限公司)，白介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)以及D-乳酸酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒均購自福州邁新生物科技有限公司，琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)、淀粉酶活性檢測試劑盒(南京建成生物科技有限公司)，D-木糖比色法檢測試劑盒(美國Sigma公司)、蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(北京中杉生物工程公司)、Trziol 總RNA抽提試劑盒(北京天根生物技術(shù)有限公司)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcriptase polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(日本TaKaRa公司)、GR-B2074FNA型低溫冰箱(韓國LG公司)、超速低溫離心機(jī)(德國eppendorf公司)，JB-L6型包埋機(jī)及JJQ-P2016J型切片機(jī)(購自武漢俊杰電子有限公司)，PB203-N型電子天平(德國Sartorious公司)、ELX808型酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、CX21型光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)以及ABI7500型全自動(dòng)熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1分組、建模及給藥 40只健康雄性Wistar大鼠40只隨機(jī)分為空白組、模型組、蒙脫石散組與大蒜素組，每組10只；除空白組外，均以水環(huán)境小平臺(tái)站立法聯(lián)合高乳糖飼料喂養(yǎng)建立慢性腹瀉大鼠模型[6]，高乳糖飼料持續(xù)喂養(yǎng)2周，并每天將大鼠置于特質(zhì)凸面小木臺(tái)(周邊注水)8～10 h，自由活動(dòng)，見大鼠精神萎靡、皮毛稀疏、肛門口糞便污染、腹部膨隆及持續(xù)腹瀉，視為建模成功[7]。腹瀉動(dòng)物模型復(fù)制成功后，蒙脫石散組給予1.0 g/kg蒙脫石散藥液灌胃，大蒜素組給予30 mg/kg大蒜素注射液(人等效劑量)灌胃，空白組、模型組均給予15 mL/kg生理鹽水灌胃，1次/d，持續(xù)1周。

1.2.2腹瀉情況觀察 給藥1周后觀察每只大鼠排便情況，以腹瀉指數(shù)、稀便率、稀便等級(jí)作為腹瀉評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)[8]。腹瀉指數(shù)=稀便率×稀便等級(jí)，稀便率=每只大鼠所排稀便量(以稀便污染濾紙直徑判斷)/每只動(dòng)物總糞便量×100.0%；稀便等級(jí)用于評(píng)估稀便程度，以稀便污染濾紙直徑作為分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，直徑<1 cm為1級(jí)、直徑1～1.9 cm為2級(jí)、直徑2～3 cm為3級(jí)、直徑>3 cm為4級(jí)，以各組大鼠稀便分級(jí)均值作為各組稀便等級(jí)。腹瀉率=腹瀉大鼠數(shù)目/各組大鼠總數(shù)量×100.0%。

1.2.3采樣、腸胃吸收功能及通透性評(píng)估 末次給藥1 h時(shí)番瀉葉浸液灌胃、2 h時(shí)以3%D-木糖灌胃(20 mL/kg)。末次給藥12 h時(shí)，戊巴比妥麻醉，腹部備皮、消毒、經(jīng)腹部正中線打開腹腔，分離腹主動(dòng)脈，采集腹主動(dòng)脈血，離心后分離血清用于D-木糖、D-乳酸含量及炎癥因子、能量代謝因子水平測定，并結(jié)扎回盲及幽門部，取小腸組織，稱濕重，烘干96 h時(shí)繼續(xù)稱重，以減重法[9]計(jì)算小腸含水量；取小腸下段，用于腸黏膜組織學(xué)觀察及腸黏膜組織TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)水平檢測。

1.2.4D-木糖、D-乳酸含量及炎癥因子、能量代謝因子水平測定 取各組大鼠血清，采用比色法測定D-木糖含量及SDH、淀粉酶活性，ELISA法測定D-乳酸、IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2水平[10]。

1.2.5腸黏膜組織學(xué)改變 取2 cm小腸下段，觀察腸黏膜充血及水腫情況，剪開腸管，4%多聚甲醛固定，脫水后石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，自來水沖洗，蘇木素染液染色5～13 min，自來水沖洗1～5 min，梯度乙醇分化，自來水沖洗，返藍(lán)，洗滌后加入伊紅染液染色5 min，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察腸黏膜水腫、炎細(xì)胞浸潤、潰瘍、上皮損傷情況并評(píng)分。(1)腸黏膜水腫：無水腫為0分，輕度水腫為1分，中度水腫為2分，重度水腫為3分。(2)炎細(xì)胞浸潤：無浸潤為0分，浸潤黏膜下層為1分，浸潤肌層為2分，浸潤漿膜層為3分。(3)潰瘍：無潰瘍?yōu)?分，潰瘍深度累及黏膜下層為1分，潰瘍深度累及肌層為2分，潰瘍深度累及漿膜層為3分。(4)上皮損傷：無損傷為0分，出現(xiàn)潰爛為1分，出現(xiàn)潰瘍?yōu)?分。隨機(jī)取5個(gè)高倍視野測定絨毛高度與絨毛表面積(絨毛半徑×絨毛高度)[11]。

1.2.6腸黏膜組織TLR4、NF-κBmRNA表達(dá) 采用逆轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)法測定小腸組織TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)，參照Trizol抽提試劑盒使用說明提取小腸組織RNA，紫外分光光度確定濃度及純度滿意后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系為總RNA 5 μg+隨機(jī)引物2 μL+無RNA酶純化水補(bǔ)足至13 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件為65 ℃加熱10 min變性，冷卻；反應(yīng)管內(nèi)加入5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μL + R Nase抑制劑0.5 μL +dNTP混合液2.0 μL+逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，加熱至85 ℃，共5 min，逆轉(zhuǎn)酶失活后，停止反應(yīng)，獲得cDNA，TLR4、NF-κB及內(nèi)參引物設(shè)計(jì)及合成均由上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)及合成，具體見表1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×SYBR Green Master Mix 5 μL+上下游引物各1 μL+cDNA模板1 μL+雙蒸水補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，共42個(gè)循環(huán)，每樣本均設(shè)3復(fù)孔，參照2-△△Ct公式計(jì)算TLR4、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量[12]。

表1 TLR4、NF-κB及內(nèi)參引物序列Tab.1 Primer sequences of TLR4, NF-κB, and internal control gene

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠腹瀉情況

由表2可見，治療1周時(shí)，模型組、蒙脫石散組、大蒜素組大鼠的稀便率、稀便等級(jí)、腹瀉指數(shù)及腹瀉率均高于空白組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組稀便率、稀便等級(jí)、腹瀉指數(shù)及腹瀉率低于模型組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組腹瀉情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 治療1周時(shí)各組大鼠腹瀉情況Tab.2 Diarrhea status in each group after 1 week

2.2 胃腸吸收功能及通透性

由表3可見，治療1周時(shí)，空白組、蒙脫石散組、大蒜素組D-木糖水平高于模型組，D-乳酸水平低于模型組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組、空白組D-木糖、D-乳酸水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，各組小腸含水量對(duì)比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠胃腸吸收功能及通透性比較Tab.3 Gastrointestinal absorption function and

2.3 血清IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、SDH及淀粉酶

由表4可見，治療1周時(shí)模型組、蒙脫石散組、大蒜素組血清IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2均高于空白組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組IL-1β、IL-6、TNF-α及PGE2低于模型組，SDH、淀粉酶活性高于模型組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組以上指標(biāo)對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2、SDH及淀粉酶水平Tab.4 Serum levels of IL-1β, IL-6, TNF-α, PGE2, the activities of SDH，and amylase in each

2.4 腸黏膜組織學(xué)觀察

由表5可見，治療1周時(shí)，模型組、蒙脫石散組、大蒜素組大鼠的腸黏膜水腫、炎細(xì)胞浸潤、潰瘍、上皮損傷評(píng)分均高于空白組(P<0.05)，絨毛高度、絨毛表面積低于空白組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組大鼠的腸黏膜水腫、炎細(xì)胞浸潤、潰瘍、上皮損傷評(píng)分低于模型組，絨毛高度、絨毛表面積高于模型組(P<0.05)；蒙脫石散組、大蒜素組大鼠的以上指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組大鼠腸黏膜病理及形態(tài)改變見圖1。空白組大鼠的腸黏膜形態(tài)正常，無明顯病理改變，黏膜肌層厚度正常，絨毛高度正常；模型組大鼠的小腸黏膜肌層變薄、絨毛縮短，伴不同程度絨毛頂部上皮細(xì)胞脫落，見明顯充血、水腫，不同程度潰瘍；蒙脫石散組及大蒜素組大鼠的腸黏膜僅有輕度充血及水腫，肌層厚度基本恢復(fù)正常，絨毛高度增加、炎性浸潤減輕。

表5 各組大鼠腸黏膜組織學(xué)觀察Tab.5 Histological observation of intestinal mucosa in each

圖1 各組大鼠腸黏膜組織(HE,×100)Fig.1 Intestinal mucosa tissues in each group (HE,×100)

2.5 大鼠腸黏膜組織TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)

由表6可見，治療1周時(shí)，模型組、蒙脫石散組、大蒜素組大鼠腸黏膜組織TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)水平均高于空白組(P<0.05)，蒙脫石散組、大蒜素組低于模型組(P<0.05)，蒙脫石散組與大蒜素組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表6 各組大鼠腸黏膜組織TLR4和NF-κB mRNA表達(dá)Tab.6 The expression levels of TLR4 and NF-κB mRNA in intestinal mucosa tissues in each group

3 討論

有研究報(bào)道，因腹瀉所致嬰幼兒死亡率超過10%，世界范圍內(nèi)每年死于腹瀉患兒超過200萬[13]。慢性遷延、持續(xù)性腹瀉約占全部腹瀉的60%，常導(dǎo)致腸黏膜轉(zhuǎn)運(yùn)障礙、消化酶分泌異常，影響兒童營養(yǎng)物質(zhì)吸收，對(duì)其生長發(fā)育造成不良影響[14]。前期諸多報(bào)道均認(rèn)為血管活性腸肽、生長抑素動(dòng)態(tài)平衡打破，免疫抑制，結(jié)膜體表電活動(dòng)異常等與慢性腹瀉發(fā)生有關(guān)[15]。近年來較多證據(jù)顯示，TLR4所誘導(dǎo)NF-κB活化而引起炎癥反應(yīng)參與炎癥性腸病、腹瀉型腸易激綜合征發(fā)病過程，或可能與慢性腹瀉發(fā)生有關(guān)[16]。本研究采用水環(huán)境小平臺(tái)站立法聯(lián)合高乳糖飼料喂養(yǎng)法成功復(fù)制了慢性腹瀉大鼠模型，使大鼠攝入超消化負(fù)荷乳糖，形成高滲環(huán)境，導(dǎo)致水電解質(zhì)紊亂，引發(fā)腹瀉。發(fā)現(xiàn)慢性腹瀉模型組大鼠呈現(xiàn)活動(dòng)減少、腹部膨隆、皮毛稀疏等表現(xiàn)，腹瀉率、腹瀉指數(shù)、稀便率及稀便等級(jí)均較高，提示采用該方法復(fù)制慢性腹瀉模型有較高的可行性。同時(shí)本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，慢性腹瀉模型大鼠腸黏膜組織TLR4、NF-κBmRNA均較空白組高，同時(shí)相關(guān)炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、PGE2均高于空白組，推測慢性腹瀉常伴TLR4/NF-κB通路活化，導(dǎo)致NF-κB下游靶點(diǎn)激活，釋放大量炎癥因子，與NF-κB DNA結(jié)合，加重腸黏膜炎癥浸潤程度。

而大蒜素為大蒜含硫化合物成分，有典型抗炎、抗感染、殺菌、抗氧化等作用[17]。已有研究證實(shí)，大蒜素主要成分可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞分化、增殖[18]。也有報(bào)道指出，大蒜素可通過干擾核因子轉(zhuǎn)錄激活保護(hù)腸黏膜功能，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)[19]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，慢性腹瀉大鼠模型經(jīng)大蒜素注射液灌胃1周后TLR4、NF-κBmRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組明顯降低，與空白組相對(duì)接近，同時(shí)大鼠腹主動(dòng)脈炎性因子表達(dá)均降低，能量代謝酶SDH及淀粉酶活性均上升，D-木糖上升，D-乳酸水平降低，腸黏膜受損改善，充血、水腫、潰瘍及炎癥浸潤程度明顯減輕，絨毛高度基本恢復(fù)正常，腸黏膜能量代謝速度加快，腸道吸收能力增強(qiáng)，腹瀉癥狀改善，腹瀉指數(shù)及腹瀉率均降低，與蒙脫石散組(陽性對(duì)照)接近，提示大蒜素與蒙脫石散存在類似的拮抗腹瀉作用，推測大蒜素可能通過干擾TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抗炎作用。NF-κB為TLR4下游信號(hào)通路，系炎癥反應(yīng)中最關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫調(diào)節(jié)及炎癥細(xì)胞增殖、分化等過程，而大蒜素有其獨(dú)特抗炎、抗菌、免疫調(diào)節(jié)作用，可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路下游NF-κB信號(hào)激活，阻止活化后炎癥因子釋放及其與NF-κB結(jié)合，降低TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)，阻止NF-κB持續(xù)激活所致炎性反應(yīng)，形成正向調(diào)控機(jī)制，抑制該通路活化后胃腸刺激相關(guān)因子表達(dá)，降低大鼠腸黏膜炎性浸潤程度，恢復(fù)腸黏膜正常能量代謝，提升腸道酶活性，平衡腸道消化吸收功能，促進(jìn)腸黏膜修復(fù)，進(jìn)而改善腹瀉、降低腹瀉率與腹瀉指數(shù)[20-21]。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，TLR4/NF-κB信號(hào)通路活化可放大炎癥效應(yīng)，影響腸道能量代謝，導(dǎo)致腸黏膜功能受損，影響腸道消化吸收，造成慢性腹瀉；而大蒜素可能通過干擾TLR4/NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制下游NF-κB活化，抑制炎癥因子釋放，恢復(fù)腸道酶活性及能量代謝，改善腸黏膜功能，促進(jìn)慢性腹瀉大鼠腸黏膜修復(fù)，或可能為慢性腹瀉治療研究的新靶點(diǎn)。