葉財(cái)發(fā)，蔡躍輝，曾棋平，曹毅祥，王慶芬

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院/廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院制劑科，福建漳州 363000)

復(fù)方首烏藤合劑又名健腦合劑，為聯(lián)勤保障部隊(duì)第九O九醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科常用特色方劑，臨床應(yīng)用30多年，由首烏藤、合歡皮、菟絲子、五味子、續(xù)斷、蔓荊子、川芎、煅牡蠣8味中藥組成，具有養(yǎng)心安神解郁、滋陰養(yǎng)肝、行血活氣之功效，主要用于神經(jīng)衰弱性失眠、眩暈及腦外傷引起的頭痛、頭暈等癥[1]。復(fù)方首烏藤合劑組方復(fù)雜，成分多樣，該制劑的現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)主要控制其總黃酮、二苯乙烯苷的含量[2]，未包含多糖含量控制，然而相關(guān)研究[3-6]表明，多糖具有預(yù)防、改善、治療失眠的作用，且滋陰養(yǎng)肝效果明顯。為了更有效地控制該制劑的質(zhì)量，本研究擬建立一種同時(shí)測定多糖中單糖含量的方法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材 料

1.1 試藥 甘露糖(批號(hào)140651-201504，含量99.4%)、鹽酸氨基葡萄糖(批號(hào)140649-201606，含量100%)、半乳糖醛酸(批號(hào)111646-201702，含量95.1%)、葡萄糖(批號(hào)110833-201707，含量99.9%)、半乳糖(批號(hào)160226-201506，含量100%)、阿拉伯糖(批號(hào)111506-200202，含量100%)均購于中國食品藥品檢定研究院；三氯甲烷、正丁醇、氫氧化鈉、鹽酸、甲醇、乙醇、三氟乙酸、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)和三氟乙酸為分析純；乙腈為色譜純；水為本院自制純化水。

復(fù)方首烏藤合劑(規(guī)格40 ml/支，批號(hào)20190605、20190606、201906121、201906122、201906123、201906131、201906132、201906133、201906134、20190624，分別稱為S1、S2、……、S10，本院自制)。

1.2 儀器 Agilent 1200 HPLC系統(tǒng)(包括DAD檢測器，美國Agilent公司)；AUX220電子分析天平(精度0.1 mg，日本島津公司)；KQY78-1磁力加熱攪拌器、HH系列數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市科析儀器有限公司)； LD5-2A電動(dòng)離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；101A-1E電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；KQ-500B超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；DZF-6050真空干燥箱(上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠)。

2 方法和結(jié)果

2.1 復(fù)方首烏藤合劑多糖的制備 精密吸取25 ml復(fù)方首烏藤合劑，加入三氯甲烷-正丁醇(5∶1)混合液20 ml，在磁力攪拌器上攪拌30 min，以1.431×103×g離心20 min，回收上清液[7]。乙醇沉淀[8]：向上清液中加入3倍體積的95%乙醇，保持乙醇濃度在70%以上，靜置過夜。以1.431×103×g離心15 min，收集沉淀物，于80 ℃真空干燥3 h，得到相應(yīng)批號(hào)的復(fù)方首烏藤合劑多糖粉末，備用。

2.2 對(duì)照品溶液的配制

2.2.1 單糖對(duì)照品溶液的配制 分別精密稱取甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖對(duì)照品適量，配制成濃度分別為3.1、1.276、1.01、1.0、1.18、1.04 mg/ml的單糖對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 混合對(duì)照品溶液的配制 分別精密吸取2.2.1項(xiàng)下的單糖對(duì)照品溶液各1 ml于同一10 ml容量瓶中，加水定容成混合對(duì)照品溶液，備用。

2.3 復(fù)方首烏藤合劑多糖的水解 精密稱取2.1項(xiàng)下的多糖粉末150 mg，置于10 ml頂空瓶中，加3 ml水，再加三氟乙酸3 ml，封管，于110 ℃烘箱中水解1 h，取出，放冷，水浴蒸干，用甲醇1 ml溶解，蒸干，重復(fù)處理3次以除去殘留的三氟乙酸，殘?jiān)铀芙鈁8]，轉(zhuǎn)移至5 ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，即得復(fù)方首烏藤合劑多糖水解液。

2.4 衍生化物溶液的制備 精密吸取單糖對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液、復(fù)方首烏藤合劑多糖水解液1 ml分別置于10 ml Eppendorf管中，分別加入1.0 ml PMP甲醇溶液(0.5 mol/L)和1.0 ml氫氧化鈉溶液(0.3 mol/L)，混合均勻，于70 ℃水浴放置50 min，取出后冷卻至室溫，分別加入1.0 ml 0.3 mol/L 鹽酸溶液中和，再加入2 ml三氯甲烷萃取，取上清液，重復(fù)處理 3 次[8]，除去未反應(yīng)的PMP，用0.22 μm 濾膜過濾，即得。

2.5 色譜條件 色譜柱:依利特Krosmasil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱溫35 ℃；流動(dòng)相:乙腈-0.1 mol/L磷酸二氫鈉緩沖液(pH=6.8)(18∶82)；流速1.0 ml/min；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量10 μl。

2.6 多糖特征峰的確認(rèn) 通過對(duì)比單糖對(duì)照品溶液、混合對(duì)照品溶液和復(fù)方首烏藤合劑多糖水解液的衍生化物溶液的保留時(shí)間，對(duì)色譜圖中主要色譜峰進(jìn)行歸屬(見圖1)，共識(shí)別出甘露糖、鹽酸氨基葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖6種單糖。由于鹽酸氨基葡萄糖峰面積小于6種單糖總峰面積的1%，基線對(duì)峰面積結(jié)果影響大，不適宜定量分析，故本研究擬以甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖為目標(biāo)單糖并測定其含量。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 線性關(guān)系 精密吸取2.4項(xiàng)下的衍生化物溶液，按照2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積為0.5、2、5、10、13、15、20、25、30 μl，測定5種單糖成分的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)建立回歸方程，見表1。

2.7.2 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.4項(xiàng)下中混合衍生化物溶液，按照2.5項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，測得甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、 阿拉伯糖峰面積的RSD分別為0.12%、 0.65%、 0.15%、0.20%和0.13%(n=5)，表明儀器的精密度良好。

圖1 復(fù)方首烏藤合劑多糖的HPLC譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of polysaccharides in compound Polygoni Multiflori Caulis mixtureA:混合對(duì)照品溶液；B:復(fù)方首烏藤合劑多糖水解液；1:1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮； 2：甘露糖；3：鹽酸氨基葡萄糖；4：半乳糖醛酸；5：葡萄糖；6：半乳糖；7：阿拉伯糖

表1 5種單糖類成分的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear regression equations and correlation coefficients of 5 monosaccharides

2.7.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密吸取復(fù)方首烏藤合劑(批號(hào)20190624)6份，按照2.1項(xiàng)下方法提取多糖組分，按2.3、2.4項(xiàng)下方法制備衍生物，再按2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，測得甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為2.06%、3.71%、1.33%、1.87%和2.68%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取復(fù)方首烏藤合劑多糖水解液衍生化物溶液(批號(hào)20190624)，按照2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，分別于0、2、4、8、12、16、20 h進(jìn)樣，測得甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD分別為1.26%、3.64%、0.65%、0.40%和0.87%(n=2)，表明供試品溶液在20 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.7.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密吸取已知含量的復(fù)方首烏藤合劑多糖水解液(批號(hào)20190624)0.5 ml，精密加入0.5 ml一定濃度的對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法水解，按2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生，再按2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測定并計(jì)算各成分的加樣回收率，結(jié)果見表2。甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的加樣回收率分別為103.73%、99.41%、103.44%、103.19%和97.64%，RSD分別為2.25%、0.64%、1.75%、1.15%和2.98%(n=6)，表明該方法的準(zhǔn)確度良好。

表2 各批次復(fù)方首烏藤合劑中單糖的含量測定結(jié)果Table 2 Content determination results of monosaccharides in compound Polygoni Multiflori Caulis mixture (ρB/mg·ml-1)

2.8 多糖中單糖的含量測定 取10批復(fù)方首烏藤合劑，精密吸取各批次的多糖水解液，按照2.4項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生，再按2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，并計(jì)算各批合劑中單糖成分的含量，結(jié)果見表2。甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖的含量范圍分別為3.35～5.21、0.17～0.37、1.59～2.32、0.46～0.78和0.15～0.27 mg/ml。不同批次間單糖的含量差異較大，RSD在13%～25%，但是不同批次中甘露糖含量均最高，葡萄糖次之。

3 討 論

本研究比較了25 ℃、30 ℃、35 ℃三種不同柱溫，發(fā)現(xiàn)各待測成分的分離度和理論塔板數(shù)均能達(dá)到要求。柱溫為35 ℃時(shí)，整體出峰時(shí)間最快，峰形及分離度均較好，故選擇35 ℃為檢測柱溫。另外，采用梯度洗脫方法時(shí)，色譜分離時(shí)間長，且改變溫度或有機(jī)相比例均會(huì)影響各個(gè)特征峰的分離度或者峰形，故選擇等度洗脫。

目前植物多糖提取主要集中在中藥原藥材[7,9]，較少應(yīng)用于液體制劑。本研究主要參考劉曉晴[8]提取大柴胡湯多糖成分所用的水提醇沉法制備復(fù)方首烏藤合劑多糖，旨在去除該制劑中的蛋白質(zhì)和植物單糖。前期研究發(fā)現(xiàn)，水提醇沉法提取后的多糖仍然含有少量的植物單糖，但是含量均較少，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較小，可忽略不計(jì)，因此水提醇沉法可以應(yīng)用于提取復(fù)方首烏藤合劑中的多糖成分。

本研究結(jié)果表明，10批復(fù)方首烏藤合劑中的甘露糖含量均遠(yuǎn)高于其他單糖，約占總多糖含量的50%，葡萄糖占比約30%，可能是其主要活性物質(zhì)。該制劑多糖中的單糖成分可能是其具有較強(qiáng)滋陰保肝功效的原因。查閱其他液體成品制劑，未見類似報(bào)道，可據(jù)此進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本研究建立柱前衍生化法結(jié)合HPLC法同時(shí)測定復(fù)方首烏藤合劑多糖中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖含量，可用于這5種單糖的定性及定量分析，為復(fù)方首烏藤合劑多糖質(zhì)量控制提供參考。