周金金，范國榮，3*

[1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530200；2.上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海200080；3.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院藥物分析學(xué)教研室，上海市藥物(中藥)代謝產(chǎn)物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433]

霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)是臨床常用免疫抑制劑嗎替麥考酚酯的活性代謝產(chǎn)物，因其肝毒性、腎毒性低，耐受性好，已被廣泛應(yīng)用于腎、肝或其他組織器官移植后的排異反應(yīng)和某些自身免疫性疾病的治療[1]。有研究表明， MPA的藥動學(xué)和藥效學(xué)存在極大的個體差異，濃度與療效之間個體差異很大，濃度與藥品不良反應(yīng)(ADRs)之間也有相關(guān)性[2]。而通過治療藥物監(jiān)測(therapeutic drug monitoring,TDM)調(diào)整用藥劑量，實(shí)現(xiàn)個體化精準(zhǔn)用藥，可以進(jìn)一步優(yōu)化MPA的使用，較好地改善患者預(yù)后。

MPA的代謝產(chǎn)物主要為霉酚酸葡萄糖苷(7-O-mycophenolic acid-glucuronide,MPAG)和?；狗铀崞咸烟擒?acyl-mycophenolic acid-glucuronide，AcMPAG)。有研究表明，MPAG本身無藥理活性，但在短暫的肝腸循環(huán)作用下重新形成MPA，使MPA暴露量增加，導(dǎo)致毒性反應(yīng)的發(fā)生[3-4]；另一代謝產(chǎn)物AcMPAG在體內(nèi)堆積過多時也會引發(fā)血液疾病、胃腸道功能紊亂、感染等ADRs[5]。代謝產(chǎn)物的血藥濃度與ADRs的關(guān)系備受關(guān)注，因此，同時檢測MPA的代謝產(chǎn)物MPAG、AcMPAG的濃度，評價相關(guān)ADRs很重要。目前已有的檢測方法有酶放大免疫(enzyme-multiplied immunoassay technique,EMIT)法[6]、HPLC法[7]、LC-MS/MS法[8]和毛細(xì)管電泳法[9]等，但關(guān)注點(diǎn)往往集中在霉酚酸或者一種代謝產(chǎn)物上。本研究以艾司唑侖為內(nèi)標(biāo)，建立了能同時測定人血漿中MPA、MPAG、AcMPAG的HPLC法，并應(yīng)用于患者血藥濃度監(jiān)測，為臨床合理使用嗎替麥考酚酯等藥物提供參考。

1 材 料

1.1 儀器 Ultimate 3000高效液相色譜儀(美國Thermo公司，包括U3000-VWD檢測器和Chromeleon工作站)；HY-5渦旋混合器(美國SI公司)；Centrifuge 5804 R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司)；CPA225D十萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯公司)；SK7200H超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；Hi-Tech水純化系統(tǒng)(上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試劑 MPA對照品(純度98%，批號24280-93-1，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司)；MPAG(純度98.36%，批號31528-44-6)、AcMPAG對照品(純度95%，批號99043-04-6，加拿大Toronto Research Chemicals公司)；艾司唑侖對照品(純度98%，批號171219-0102，大連美侖生物技術(shù)有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國Merck公司)；偏磷酸(HPO3,分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸二氫鈉(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)?？瞻籽獫{采自上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院的健康志愿者。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Welch Xtimate C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇(A)-10 mmol/l NaH2PO4(pH 3.0)水溶液(B)，梯度洗脫：0～15 min，46%～30% B，15～20 min，30%～40% B。流速為1.0 ml/min，檢測波長215 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量20 μl。

2.2 對照品溶液與工作液的配制 精密稱取MPA、MPAG、AcMPAG、艾司唑侖對照品，用甲醇溶解、稀釋并定容，得到濃度分別為1.00、2.50、1.00、1.00 mg/ml的儲備液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩⑸鲜鰞湟河?0%甲醇逐級稀釋得到工作液。工作液中MPA、AcMPAG濃度均為1.96、3.91、7.82、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00 μg/ml，MPAG濃度為3.91、7.82、15.63、31.25、62.50、125.00、250.00、500.00 μg/ml，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。另配制MPA、AcMPAG濃度均為2.50、25.00、200.00 μg/ml及MPAG濃度為5.00、50.00、400.00 μg/ml的低、中、高濃度混合質(zhì)控工作液，于-20 ℃保存?zhèn)溆?。艾司唑侖?nèi)標(biāo)溶液的濃度為20.00 μg/ml，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 血漿樣品前處理 精密吸取10 μl工作液，置于1.5 ml Eppendorf管中，加入90 μl空白血漿，再加入10 μl濃度為20 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋振蕩30 s，加入50 μl 10% 偏磷酸后混勻，再加入50 μl乙腈進(jìn)行蛋白沉淀，渦旋振蕩1 min，以2.081 7×g離心5 min(4 ℃)，取上清進(jìn)樣分析，進(jìn)樣體積20 μl。

2.4 專屬性實(shí)驗(yàn) 取6份不同來源的空白血漿，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測，觀察色譜圖的出峰情況，考察內(nèi)源性物質(zhì)及其他物質(zhì)是否對待測物有干擾。結(jié)果在本研究條件下，MPAG、AcMPAG、內(nèi)標(biāo)艾司唑侖及MPA的出峰時間分別為4.623、6.627、9.007和10.977 min，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對測定無干擾，聯(lián)用藥物如他克莫司、潑尼松對MPA、MPAG、AcMPAG及內(nèi)標(biāo)的測定無干擾，見圖1。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取10 μl 2.2項(xiàng)下混合工作液，加入90 μl空白血漿中，配制成MPA、AcMPAG濃度為0.196、0.391、0.782、1.563、3.125、6.25、12.5、25.0 μg/ml和MPAG濃度為0.391、0.782、1.563、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，按2.3項(xiàng)下方法操作后進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測樣品峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果MPA和AcMPAG的線性范圍為0.19～25.0 μg/ml；MPAG的線性范圍為0.39～50.0 μg/ml。MPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y1=0.519 4X1+0.049，r=0.999 1；MPAG的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y2=0.455 5X2+0.503，r=0.999 4；AcMPAG的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y3=0.272 2X3+0.006 4，r=0.999 8，表明線性關(guān)系良好。

2.6 檢測限與定量下限實(shí)驗(yàn) 將工作液用50%甲醇多次稀釋后，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品前處理，再進(jìn)樣檢測，得到S/N>3的濃度，將S/N>3的濃度定義為檢測限濃度(LOD)；將標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液最低濃度定義為定量下限濃度(LLOQ)。 結(jié)果MPA、AcMPAG的檢測限為0.048 μg/ml，MPAG的檢測限為0.097 μg/ml；MPA、AcMPAG的定量下限為0.19 μg/ml，MPAG的定量下限為0.39 μg/ml。

2.7 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn) 用空白血漿配制MPA、AcMPAG濃度均為0.25、2.5、20.0 μg/ml和MPAG濃度為0.5、5.0、40.0 μg/ml的質(zhì)控樣品，每個濃度5份樣品，按2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定。每天測定一次，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積，計(jì)算批間和批內(nèi)精密度與準(zhǔn)確度，分別用RSD、RE表示。結(jié)果日內(nèi)、日間精密度RSD均<15%，準(zhǔn)確度RE均在85%～110%，見表1。

2.8 提取回收率實(shí)驗(yàn) 取2.7項(xiàng)下配制的低、中、髙濃度的質(zhì)控樣品，按2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)行測定。配制相同濃度的不含生物基質(zhì)的對照品溶液進(jìn)行測定，比較峰面積，計(jì)算提取回收率。結(jié)果MPA、MPAG、AcMPAG和內(nèi)標(biāo)艾司唑侖的提取回收率分別為92.50%～105.12%、90.58%～104.82%、86.37%～103.57%、98.11%～101.64%，RSD均<15%(n=5)。

圖1 人血漿中霉酚酸及其代謝產(chǎn)物的HPLC譜圖A：空白血漿；B：空白血漿+霉酚酸(MPA)+霉酚酸葡萄糖苷(MPAG)+?；狗铀崞咸烟擒?AcMPAG)+ 內(nèi)標(biāo)艾司唑侖(濃度分別為25.0、50.0、25.0、20.0 μg/ml)；C：患者血漿樣品；D：空白血漿+他克莫司(25.0 μg/ml)； E：空白血漿+潑尼松(25.0 μg/ml)；1：MPAG；2：AcMPAG；3：內(nèi)標(biāo)艾司唑侖；4：MPA

表1 血漿中MPA、MPAG、AcMPAG的 精密度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=5)

2.9 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 配制同2.7項(xiàng)下低、中、髙濃度的質(zhì)控樣品，于室溫放置6 h、進(jìn)樣盤放置6 h、反復(fù)凍融3次、密封低溫(-40 ℃)保存1個月，按2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定，考察不同條件下樣品的穩(wěn)定性。結(jié)果樣品在上述條件下均保持穩(wěn)定。

2.10 臨床患者血藥濃度監(jiān)測 國內(nèi)外均推薦MPA治療谷濃度為1.0～3.5 μg/ml[10]。但因存在個體差異、藥物相互作用等影響因素，MPA谷濃度暴露量與推薦治療窗有差異，因此應(yīng)對MPA進(jìn)行治療藥物監(jiān)測。

本研究收集2017-2018年上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院腎移植術(shù)后復(fù)查的門診患者28例，均長期服用麥考酚鈉腸溶片或嗎替麥考酚酯膠囊和其他免疫抑制劑。抽取患者谷濃度血樣，檢測MPA血藥濃度和生化指標(biāo)。結(jié)果MPA血藥濃度在0.154～6.65 μg/ml范圍，見表2。其中有16例患者M(jìn)PA谷濃度不在1.0～3.5 μg/ml范圍內(nèi)，與推薦治療范圍有差異，但患者肝、腎功能指標(biāo)均在正常范圍，身體機(jī)能處于穩(wěn)定狀態(tài)，未發(fā)生ADRs，因此維持用藥劑量不變?？紤]到患者由于個體間代謝差異、飲食等因素影響，是否調(diào)整用藥劑量和用藥方案確保機(jī)體各指標(biāo)正常，需繼續(xù)進(jìn)行臨床TDM。

表2 28例腎移植患者霉酚酸血藥濃度分布范圍

3 討 論

3.1 色譜條件的考察 在選擇流動相時,本研究考察了5、10、15 mmol/L NaH2PO4對各待測物出峰的影響，并且在酸堿度的選擇上，為契合各化合物的性質(zhì)，使待測物在洗脫過程中穩(wěn)定存在，不黏附，經(jīng)優(yōu)化后最終選擇了10 mmol/L NaH2PO4(pH 3.0)作為水相。

本研究參考國內(nèi)外文獻(xiàn)，研究了不同型號色譜柱如Waters Symmetry C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters XBridge C18柱(150 mm×4.6 mm，3.5 μm)、Welch Xtimate C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-AQ柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)、Waters Atlantis T3柱(100 mm×3 mm，3 μm)，發(fā)現(xiàn)待測物在填充粒徑為5 μm、內(nèi)徑為4.6 mm的色譜柱中出峰結(jié)果較好。待測物在250 mm柱長的色譜柱中能更快出峰，從而節(jié)省了總的運(yùn)行時間。代謝產(chǎn)物MPAG、AcMPAG極性較高，含有的基團(tuán)增加了其親水性，不同填充材料和不同鍵合相對色譜分離也有影響。AQ、C18色譜柱和T3色譜柱在洗脫化合物時也能達(dá)到分離的目的，但MPA和MPAG、AcMPAG極性相差較大，且調(diào)節(jié)流動相發(fā)現(xiàn)，MPA對水相的變化較敏感，不能同時滿足時間短、分離度好的要求，而使用Welch Xtimate C8色譜柱，在40 ℃的柱溫、合適的流動相條件下具有較好的分離度，峰型也比較好，在12 min內(nèi)4種物質(zhì)均能出峰，滿足檢測的要求。

本研究在200～600 nm波長掃描后發(fā)現(xiàn)，MPA、MPAG、AcMPAG在215、254、305 nm波長下均有紫外吸收，代謝產(chǎn)物MPAG、AcMPAG在215 nm波長下吸收更強(qiáng)。與文獻(xiàn)[11]中報道的使用UV檢測MPA、AcMAG，熒光檢測MPAG，使用雙內(nèi)標(biāo)的方法相比較，本研究采用215 nm檢測波長，靈敏度高，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，能同時檢測3種待測物及內(nèi)標(biāo)。

3.2 樣品前處理?xiàng)l件的考察 文獻(xiàn)報道的血漿樣品前處理方法有固相萃取法[12]、液-液萃取法[13]和蛋白沉淀法[6]。本研究比較這3種樣品前處理方法。固相萃取實(shí)驗(yàn)中使用的萃取小柱消耗高、成本高；在液-液萃取實(shí)驗(yàn)中，本研究考察了不同的有機(jī)溶劑乙酸乙酯、叔丁基甲基醚、異丙醇、二甲亞砜對待測物回收率的影響，發(fā)現(xiàn)液-液萃取法中待測物的回收率不足40%，且過程耗時長；在蛋白沉淀法實(shí)驗(yàn)中，通過對比用硫酸鋅、鎢酸鈉、高氯酸、偏磷酸、乙腈、甲醇對樣品進(jìn)行前處理后發(fā)現(xiàn)，同時加入乙腈和10%偏磷酸前處理樣品，待測物的回收率>70%，準(zhǔn)確性好，且操作簡便、快速，能滿足檢測要求。本研究經(jīng)過考察，最終選用同時加入乙腈和10%偏磷酸前處理樣品的蛋白沉淀法。

3.3 內(nèi)標(biāo)的選擇 本研究考察了不同的內(nèi)標(biāo)如阿立哌唑、苯妥英鈉、艾司唑侖、氯丙嗪等，發(fā)現(xiàn)艾司唑侖不干擾待測物，響應(yīng)好，因此選用艾司唑侖作為內(nèi)標(biāo)。

本研究建立了一種簡便、可靠、能同時檢測人血漿中MPA、MPAG、AcMPAG濃度的HPLC法，可用于患者M(jìn)PA血藥濃度監(jiān)測，為臨床合理、安全、有效用藥提供技術(shù)支持，進(jìn)一步保障用藥安全。