沈雷 姜楊 張善強(qiáng) 金海峰 姚立杰 張嵩 劉丹陽 李永濤王璐璐

每年全世界死于肺癌的有60萬人[1]，目前各種方法仍無法阻止肺癌發(fā)展[2]。研究認(rèn)為，肺癌組織含有的肺癌干細(xì)胞可能來源于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）[3-4]。MSCs具有向遠(yuǎn)處組織定向遷移等能力，還能夠成為腫瘤樣細(xì)胞[5]。目前認(rèn)為，結(jié)腸癌或乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展及腫瘤干細(xì)胞的形成均與MSCs密切相關(guān)[6]。但是肺癌微環(huán)境招募MSCs遷移的影響還需要深入研究。

趨化因子是一類肽類家族，該類因子與MSCs表面受體相互結(jié)合，具有促進(jìn)MSCs等細(xì)胞遷移的作用[7]。趨化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）隨著結(jié)腸癌發(fā)展呈現(xiàn)高表達(dá)，與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。但是基于CXCL-8的A549細(xì)胞與MSCs之間的關(guān)系還鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從趨化因子角度驗(yàn)證不同濃度A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs細(xì)胞遷移的影響，為靶向抑制MSCs遷移到肺癌微環(huán)境奠定研究基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑、儀器 研究時(shí)間為2018年1月-2019年10月，人A549細(xì)胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司；人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）由本實(shí)驗(yàn)室保存。α-MEM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Thermo公司；MTT、二甲基亞砜（DMSO）購于Sigma公司；RIPA細(xì)胞裂解液、苯甲基磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒為碧云天生物公司產(chǎn)品，小鼠抗人CXCL-8單克隆抗體和小鼠抗人β-actin抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG為英國Abcam公司產(chǎn)品；人Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。日本Olympus公司的BX50型倒置顯微鏡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞。含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)hBMSCs。所有細(xì)胞均未出現(xiàn)衰老或死亡現(xiàn)象。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 5.5×106A549細(xì)胞在37 ℃，5%的CO2培養(yǎng)6 h后，800 r/min離心3 min，提取A549細(xì)胞上清液。將A549細(xì)胞上清液用含1%FBS的α-MEM培養(yǎng)基分別按體積比5%、25%稀釋為條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）。以此兩種條件培養(yǎng)基分別培養(yǎng)hBMSCs為5%A549-CM組、25%A549-CM組，無任何刺激的hBMSCs為對(duì)照組。

1.2.3 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 1.0×104hBMSCs置于孔徑0.8 μm的Transwell細(xì)胞小室內(nèi)，下層腔室加入5%、25%條件培養(yǎng)基或正常培養(yǎng)基，37 ℃，5%的CO2繼續(xù)培養(yǎng)18 h后：棉簽擦除Transwell細(xì)胞小室內(nèi)細(xì)胞，0.01 mmol/L PBS清洗3次，2 min/次；4%多聚甲醛溶液室溫固定1 h，0.01 mmol/L PBS清洗3次，1 min/次；1%結(jié)晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1軟件計(jì)算hBMSCs細(xì)胞遷移數(shù)目。

1.2.4 ELISA ELISA試劑盒檢測(cè)各組hBMSCs裂解液的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白含量。

1.2.5 Western blot RIPA細(xì)胞裂解緩沖液裂解5.5×106各組hBMSCs，BCA蛋白定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度，分別進(jìn)行ELISA和Western blot實(shí)驗(yàn)。45 μg蛋白以10% SDS-PAGE電泳90 min后轉(zhuǎn)移至PVDF膜；5%脫脂奶粉封閉1 h，添加小鼠抗人CXCL-8單克隆抗體（1︰300）和小鼠抗人β-actin抗體（1︰700），4 ℃過夜后；再添加HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（1︰400），室溫孵育3 h；ECL發(fā)光液顯影成像，IPP 6.0.1軟件分析各蛋白條帶相對(duì)吸光度值，β-actin為內(nèi)參對(duì)照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，兩組間比較來用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs遷移的影響 對(duì)照組、5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs細(xì)胞遷移數(shù)目分別為（1 452.25±13.57）、（3 574.16±15.85），（4 523.11±13.35）個(gè)。對(duì)照組、5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs細(xì)胞遷移數(shù)目逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=145 046.61，P<0.01）。

2.2 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見表1。

表1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)的影響[μg/mL，（）]

表1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)的影響[μg/mL，（）]

*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與5%A549-CM組比較，P<0.01。

2.3 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs的CXCL-8蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組、5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs的CXCL-8蛋白表達(dá)分別為（0.51±0.01）、（0.73±0.05）、（1.39±0.06），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 435.61，P<0.01）。25%A549-CM組CXCL-8蛋白表達(dá)明顯比其余兩組增高，見圖1。

圖1 A549細(xì)胞上清液對(duì)hBMSCs的CXCL-8蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肺癌發(fā)病部位比較隱蔽，采取放射或化學(xué)藥物治療后，患者免疫力低下、并發(fā)癥較多等問題給患者身體和心理均帶來極大痛苦。癌細(xì)胞從原位置擴(kuò)散至周圍或至遠(yuǎn)處組織器官的過程中會(huì)產(chǎn)生一系列反應(yīng)，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移約占惡性腫瘤死亡率的90%[9]。MSCs具有多分化、定向歸巢能力，與腫瘤細(xì)胞干性特征相類似，雖然MSCs可能是攻克惡性腫瘤的重要細(xì)胞治療手段，但是MSCs對(duì)腫瘤組織發(fā)揮作用的前提是MSCs歸巢到腫瘤微環(huán)境內(nèi)，目前關(guān)于MSCs遷移到惡性腫瘤組織的機(jī)制還不清楚。

本實(shí)驗(yàn)觀察A549細(xì)胞對(duì)MSCs遷移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25%A549-CM組hBMSCs細(xì)胞18 h遷移率最明顯，A549細(xì)胞對(duì)hBMSCs促進(jìn)細(xì)胞遷移的能力隨著A549條件培養(yǎng)基的濃度增高而逐漸升高，這可能是由于A549惡性腫瘤細(xì)胞能夠分泌促進(jìn)腫瘤自身生長的炎癥因子或趨化因子有關(guān)[10]，這些活性因子對(duì)促進(jìn)腫瘤等細(xì)胞移動(dòng)具有重要意義。研究顯示MSCs能促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖或遷移，胃癌細(xì)胞與MSCs共培養(yǎng)時(shí)，MSCs能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖或遷移，更促進(jìn)胃癌移植瘤生長[11]。MSCs分泌趨化因子CCL5等趨化因子，增強(qiáng)了乳腺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，侵襲性和轉(zhuǎn)移能力[12]。

CXCL-8又稱為IL-8，能促進(jìn)高糖或缺氧環(huán)境下MSCs的增殖或遷移[13]。IL-8與胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤的分級(jí)分期密切相關(guān)[14]，從趨化因子角度，揭示A549肺癌微環(huán)境對(duì)MSCs的影響具有較大影響。5%A549-CM組、25%A549-CM組細(xì)胞上清液中CXCL-8蛋白含量均明顯高于對(duì)照組，說明A549細(xì)胞可以表達(dá)CXCL-8蛋白等趨化因子，CXCL-8能夠與MSCs表面CXCR1/2受體特異結(jié)合，活化細(xì)胞遷移或增殖等過程[15]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)5%A549-CM組、25%A549-CM組hBMSCs的Erk、p-Erk和PI3K、p-PI3K蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，這與研究發(fā)現(xiàn)的CXCL-8蛋白能夠激活Erk通路促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞增殖或遷移的研究結(jié)果相一致[16]。當(dāng)PI3K-Erk信號(hào)通路被激活后，細(xì)胞微絲微管發(fā)生收縮移動(dòng)，細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)會(huì)形成粘連，而細(xì)胞膜向前形成突出物，再以附著力和偽足作為支點(diǎn)，細(xì)胞整體向前移動(dòng)，當(dāng)細(xì)胞移動(dòng)離開后，這些粘附點(diǎn)就會(huì)分解，多次這樣的循環(huán)使細(xì)胞能四處移動(dòng)。肌動(dòng)蛋白會(huì)在細(xì)胞邊緣聚合形成突出物，與整合素連結(jié)的細(xì)胞骨架可調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的附著能力[17]。由此可見細(xì)胞骨架和基質(zhì)蛋白酶在細(xì)胞移行過程中扮演著重要的角色，關(guān)于CXCL-8誘導(dǎo)肺癌等惡性腫瘤細(xì)胞招募MSCs移動(dòng)的機(jī)制還需要進(jìn)一步確定。

綜上所述，A549細(xì)胞上清液含有的CXCL-8蛋白能激活hBMSCs內(nèi)PI3K-Erk信號(hào)通路，促進(jìn)hBMSCs遷移，這對(duì)揭示肺癌干細(xì)胞來源具有重要意義。