曾雨淋, 陳佳杰, 田正芳, 朱敏, 朱鈺方,3

介孔有機(jī)硅為載體的納米遞送系統(tǒng)制備及其體外化療-光熱聯(lián)合治療性能研究

曾雨淋1,2, 陳佳杰1,3, 田正芳2, 朱敏1, 朱鈺方2,3

(1. 上海理工大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200093; 2. 黃岡師范學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 催化材料制備及應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 黃岡 438000; 3. 中國(guó)科學(xué)院 上海硅酸鹽研究所, 上海 200050)

有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化的介孔有機(jī)硅納米顆粒因其高的比表面積、豐富的介孔孔道、功能性的骨架以及高的藥物裝載量等特點(diǎn)而在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。本研究提出以二硫鍵橋接的有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化介孔有機(jī)硅納米顆粒為載體共裝載化療藥物和光熱劑, 設(shè)計(jì)制備以DNA分子作為控釋“開關(guān)”修飾介孔有機(jī)硅納米顆粒的納米遞送系統(tǒng)(ICG/DOX-MONs @DNA20)。該納米遞送系統(tǒng)結(jié)合了光熱劑的光熱效應(yīng)以及DNA分子隨溫度升高而從顆粒表面脫附的特性, 可實(shí)現(xiàn)近紅外光照射激發(fā)藥物在腫瘤細(xì)胞中的控制釋放, 同時(shí)獲得藥物化療–光熱聯(lián)合治療腫瘤的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 納米遞送系統(tǒng)在近紅外光照下能迅速升溫至43 ℃以上的熱療溫度, 而且在37 ℃條件下6 h內(nèi)僅緩慢釋放藥物12.3%, 而當(dāng)溫度升至43 ℃時(shí)則快速釋放藥物52.4%; 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示該納米遞送系統(tǒng)能夠被HeLa腫瘤細(xì)胞吞噬, 在近紅外光照下有明顯的藥物化療-光熱聯(lián)合治療效果。因此, ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)在藥物化療-光熱聯(lián)合治療腫瘤方面具有應(yīng)用前景。

介孔有機(jī)硅; 納米載體; 控制釋放; 聯(lián)合治療

惡性腫瘤已成為當(dāng)今世界威脅人類健康的主要疾病之一。藥物化療是臨床上腫瘤治療的主要方法, 但是高毒性的化療藥物往往對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的毒副作用, 且腫瘤細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性而降低治療效 果[1-4]。因此, 除藥物化療外, 人們不斷探尋新型的腫瘤治療方式, 以提高腫瘤臨床治療效果。其中, 光熱治療通過(guò)近紅外光輻照在腫瘤部位聚集的光熱劑而產(chǎn)生熱量, 使得局部溫度快速上升而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞消融, 具有外源性控制、無(wú)創(chuàng)、低副作用等優(yōu)勢(shì)[5], 是實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)治療的有效策略之一。源于腫瘤的復(fù)雜性和多樣性以及以提高腫瘤治療效果為目的, 目前腫瘤治療研究已經(jīng)從單一療法逐步向聯(lián)合療法發(fā)展[6-13]。已經(jīng)有研究表明, 藥物化療與光熱治療的聯(lián)合治療模式, 不僅可以發(fā)揮各自治療方式的治療效果, 而且光熱治療引起的局部溫度升高可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性而增強(qiáng)藥物化療的治療效果。因此, 藥物化療與光熱治療的聯(lián)合治療模式顯示出顯著的超加性(即“1+1>2”)效應(yīng)[14], 其協(xié)同治療效果明顯高于單一療法。

研究表明, 納米材料能夠通過(guò)腫瘤的高通透性和滯留效應(yīng)(Enhanced permeability and retention effect, EPR)在腫瘤部位富集?；诩{米顆粒載體的腫瘤治療方式, 將化療藥物和光熱劑通過(guò)有效手段裝載于納米顆粒載體, 能夠防止藥物和光熱劑在血液循環(huán)或健康組織中的提前釋放, 成為改善治療效果和降低毒副作用的途徑之一[3,15]。近幾十年來(lái), 有機(jī)膠束、脂質(zhì)體、生物降解高分子、水凝膠、無(wú)機(jī)納米粒子等各種納米材料作為載體遞送藥物等診療劑, 其中有機(jī)納米載體化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定, 容易造成藥物等診療劑的崩解釋放, 無(wú)機(jī)納米顆粒則面臨生物降解性差等問(wèn)題[16-18]。已有研究表明, 有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化納米顆粒兼具有機(jī)納米材料和無(wú)機(jī)納米顆粒的優(yōu)點(diǎn), 能有效改善溶血[19]、增強(qiáng)生物降解性[20-21]以及降低細(xì)胞毒性等, 因此在納米遞送系統(tǒng)領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[22]。已有研究將有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化的介孔有機(jī)硅納米顆粒用于藥物遞送、成像引導(dǎo)的藥物化療等[6,23], 但以介孔有機(jī)硅納米顆粒構(gòu)建納米遞送系統(tǒng)用于藥物化療-光熱聯(lián)合治療腫瘤的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究提出以二硫鍵橋接的有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化介孔有機(jī)硅納米顆粒(Mesoporous organosilica nanoparticles, MONs)為載體共裝載化療藥物(阿霉素DOX)和光熱劑(吲哚菁綠ICG), 設(shè)計(jì)以DNA分子作為控釋“開關(guān)”修飾介孔有機(jī)硅納米顆粒的納米遞送系統(tǒng)。該納米遞送系統(tǒng)結(jié)合了ICG的光熱效應(yīng)以及DNA分子隨溫度升高而從MONs表面脫附的特性來(lái)激發(fā)DOX和ICG在腫瘤細(xì)胞中的控制釋放, 同時(shí)獲得藥物化療-光熱聯(lián)合治療腫瘤的效果。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 藥品及試劑

正硅酸四乙酯(TEOS, AR)、十六烷基三甲基氯化銨(CTAC, AR)、三乙醇胺(TEA, AR)、雙-[γ-(三乙氧基硅)丙基]-二硫化物(BTDS)、無(wú)水甲醇(AR)、無(wú)水乙醇(≥99.7%)、無(wú)水甲苯(AR)、3-氨基三乙氧基硅烷(APTES, 98%)、濃鹽酸(HCl, 36%~38%)、鹽酸阿霉素(DOX, 98%)、吲哚菁綠(ICG)、-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、嗎啉乙磺酸(MES)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、谷胱甘肽(GSH, ≥95%)和胰酶購(gòu)買于上海潤(rùn)成生物有限公司。Cell Counting Kit-8 (CCK-8試劑盒)購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。磷酸鹽藥片、DNA購(gòu)自生工生物工程(上海)有限公司, DNA序列為5’-COOH-(CH2)6-ACT CCT GGT ATG TAG CGC TA.

1.2 介孔有機(jī)硅納米顆粒的合成及氨基修飾

二硫鍵橋接的MONs制備參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[21,25]: 2 g CTAC和1 mL TEA的水溶液(10wt%)加入20 mL去離子水, 置于80 ℃油浴中加熱攪拌至其完全溶解; 接著滴加1 mL TEOS和0.2 mL BTDS的均勻混合液, 繼續(xù)反應(yīng)4 h后將白色沉淀進(jìn)行高速離心和乙醇洗滌數(shù)次, 得到含有結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑的MONs。結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑去除采用鹽酸乙醇溶液萃取法, 即將含有結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑的MONs超聲分散于300 mL鹽酸乙醇溶液(HCl:EtOH= 1: 10)中, 于80 ℃條件下油浴回流12 h, 離心分離并收集沉淀, 此萃取過(guò)程重復(fù)3次后用乙醇洗滌顆粒, 于80 ℃真空干燥后得到MONs。MONs的氨基修飾過(guò)程如下: 將100 mg MONs超聲分散于40 mL無(wú)水甲苯中, 并在100 ℃油浴中處理2 h以除盡體系中的水分; 然后向上述懸浮液中加入1.5 mL APTES, 在100 ℃條件下回流20 h后高速離心分離, 最后將離心產(chǎn)物用甲苯和乙醇洗滌3次后于60 ℃下真空干燥, 即得到氨基修飾的MONs (MONs-NH2)。

1.3 藥物/光熱劑裝載及包封

本研究以MONs-NH2為載體, 選用DOX為模型藥物、ICG為光熱劑、羧基修飾的鏈長(zhǎng)為20堿基的DNA(DNA20)為控釋“開關(guān)”構(gòu)建納米遞送系統(tǒng)。將ICG和DOX分別配制成0.5和1 mg/mL的甲醇溶液, 各取10 mL溶液混合后加入20 mg MONs-NH2,然后于室溫條件下避光攪拌24 h。最后離心分離–甲醇洗滌–離心分離后得到ICG和DOX共裝載的MONs(ICG/DOX-MONs)。

DNA20包封過(guò)程如下[25-26]: 將DNA20配制成濃度為100 μmol/L的水溶液, 并于–20 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μL DNA20溶液, 加入50 μL EDC溶液(20 mg/mL)振蕩2 min后, 再加入30 μL NHS溶液(20 mg/mL), 繼續(xù)振蕩20 min以活化DNA20的5’端羧基; 然后, 將活化的DNA20溶液加入到2 mL ICG/DOX-MONs的MES(10 mmol/L, pH 6.0)懸浮液中, 室溫避光搖晃24 h后得到DNA20包封的ICG/DOX-MONs (ICG/DOX-MONs@DNA20)。最后, 離心分離并用PBS緩沖液洗滌三次后分散于PBS緩沖液中備用。

1.4 結(jié)構(gòu)與理化性能表征

采用Tecnai G2 F30型場(chǎng)發(fā)射電子透射顯微鏡和FEI Quanta 450型場(chǎng)發(fā)射電子顯微鏡觀察顆粒的形貌和微觀結(jié)構(gòu)。采用Tristar 3020型比表面積和孔徑分析儀測(cè)定樣品的比表面積和孔徑分布。采用Nanodrop 2000C型超微量紫外–可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定藥物/光熱劑的裝載與釋放。采用808 nm近紅外激光發(fā)生器和FLIR AX5 series型紅外成像儀測(cè)定樣品的光熱性能。紅外圖譜采用KBr壓片法, 在LAM750型紅外光譜儀上測(cè)定。采用Epoch型酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞存活率。采用Olympus IX73P1F型倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞吞噬情況。采用馬爾文Nano-ZS90納米粒徑和電位分析儀測(cè)定動(dòng)態(tài)光散射(DLS)顆粒粒徑分布和顆粒表面Zeta電位。

1.5 光熱性能測(cè)試

分別配制濃度為0、20、50、100、200、300 μg/mL的顆粒懸浮液, 取1 mL置于48孔板中。用808 nm光源進(jìn)行照射, 功率密度為0.75 W/cm2, 光照時(shí)間為6 min, 使用熱成像記錄儀記錄樣品溫度, 繪制樣品溫度隨時(shí)間的變化曲線。另一方面, 對(duì)100 μg/mL顆粒懸浮液改變功率密度0.5、0.75、1、2 W/cm2, 光照6 min, 記錄樣品的升溫曲線。

1.6 藥物/光熱劑釋放性能研究

不同溫度下的藥物釋放: 將ICG/DOX- MONs@DNA20顆粒分散于PBS溶液中得到1 mg/mL的顆粒懸浮液, 取5 mL分別在37和43 ℃的水浴中振蕩, 每隔1 h取出15 μL液體同時(shí)補(bǔ)充15 μL新鮮緩沖液。使用Nanodrop 2000C測(cè)定其在480 nm (DOX)和780 nm (ICG)處的吸光度, 各測(cè)試3次, 繪制藥物釋放率隨時(shí)間變化的曲線。另外, 采用相同的方法還測(cè)定了在37和43 ℃的交替溫度情況下的DOX和ICG釋放率。

1.7 體外細(xì)胞毒性評(píng)估

本研究以小鼠的子宮頸癌細(xì)胞(HeLa)為細(xì)胞模型, 培養(yǎng)基為DMEM, 培養(yǎng)基中加入10%(/)胎牛血清(FBS)、100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素; 細(xì)胞培養(yǎng)在37 ℃、5% CO2氣氛的CO2培養(yǎng)箱中。采用標(biāo)準(zhǔn)的CCK-8方法分析MONs的體外細(xì)胞毒性。將細(xì)胞均勻地播種在96孔板中, 細(xì)胞密度為4000個(gè)/孔, 培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后去除培養(yǎng)基, 然后每孔加入100 μL MONs的DMEM溶液(濃度分別為0、12.5、25、50、100、200 μg/mL); 孵育24 h后, 吸取上層液體, 每孔加入100 μL PBS洗滌, 除去死細(xì)胞、細(xì)胞代謝物以及加入的顆粒; 接著每孔加入100 μL CCK-8溶液, 共孵育3 h后, 吸取上層液體用于酶標(biāo)儀測(cè)定其450 nm處的吸光度。另一方面, 細(xì)胞與MONs共培養(yǎng)24 h后用PBS洗滌, 除去死細(xì)胞、細(xì)胞代謝物以及加入的顆粒后, 每孔再加入100 μL新鮮DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 然后每孔加入100 μL CCK-8溶液, 共孵育3 h后, 吸取上層液體用于酶標(biāo)儀測(cè)定其450 nm處的吸光度。將MONs溶液共培養(yǎng)組的活細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)之間的比值作為細(xì)胞毒性分析的依據(jù)。

1.8 細(xì)胞吞噬

將HeLa細(xì)胞均勻播種在24孔板中, 細(xì)胞密度為5000個(gè)/孔, 待細(xì)胞貼壁后, 吸取培養(yǎng)基, 然后每孔加入500 μL的顆粒DMEM溶液(50 μg/mL), 空白組(不加顆粒)加入等體積的培養(yǎng)液; 與細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后, 吸取上層液體, 接著用PBS洗滌2次以去除未被吞噬的顆粒; 每孔加入500 μL的多聚甲醛溶液(wt%)固定細(xì)胞15 min, 用DAPI將細(xì)胞核染色5 min; 最后, 細(xì)胞用PBS洗滌3次后用倒置熒光顯微鏡觀察顆粒在細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

1.9 聯(lián)合治療

采用ICG/DOX-MONs顆粒為比較組研究ICG/DOX-MONs@DNA20的化療–光熱聯(lián)合治療效果: 配制濃度為100 μg/mL的 ICG/DOX-MONs和ICG/DOX-MONs@DNA20的DMEM溶液待用。將HeLa細(xì)胞均勻播種于96孔板中, 細(xì)胞密度為8000個(gè)/孔, 待細(xì)胞貼壁后吸取培養(yǎng)液, 加入100 μL顆粒懸浮液, 每種材料各加15個(gè)孔, 設(shè)為不光照、一次光照、兩次光照三個(gè)組, 每組5個(gè)平行樣, 空白組作為對(duì)照; 培養(yǎng)5 h后使用近紅外光照射, 功率密度為2 W/cm2, 照射時(shí)間為3 min/孔; 照射后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)3 h后, 兩次光照組重復(fù)上述光照操作, 光照后繼續(xù)培養(yǎng)3 h。然后采用與上述顆粒細(xì)胞毒性測(cè)試相同的CCK-8方法測(cè)定細(xì)胞活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 MONs的微觀形貌及結(jié)構(gòu)

MONs顆粒的形貌如圖1(a, b)所示。MONs 顆粒為球形, 顆粒尺寸均勻, 粒徑約45 nm; DLS測(cè)試顆粒粒徑尺寸比SEM和TEM觀察粒徑略大(圖1(c)), 這是因?yàn)镈LS測(cè)試得到的是顆粒的水合粒徑, 同時(shí)也與部分顆粒輕微團(tuán)聚有關(guān)。放大的TEM照片中能清晰看到均勻的介孔孔道分布。圖1(d)的N2吸附脫附等溫線及相應(yīng)的孔徑分布圖也表明MONs具有介孔結(jié)構(gòu), 其比表面積為444.5 m2/g, 平均孔徑約為4.5 nm。因此, MONs可作為納米載體裝載藥物、光熱劑等客體分子。

2.2 納米遞送系統(tǒng)制備及其理化性能

本研究的ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)制備包括MONs表面氨基修飾、ICG/DOX裝載和DNA20包封。圖2(a, b)為ICG/DOX-MONs @DNA20納米遞送系統(tǒng)制備過(guò)程各階段顆粒表面Zeta電位變化和紅外光譜圖。由圖可以看出, MONs的氨基修飾使顆粒表面Zeta電位由–16.9 mV變?yōu)?24.2 mV, 且紅外圖譜在1472 cm–1處出現(xiàn)氨基的彎曲振動(dòng)峰, 表明氨基成功修飾在MONs表面[27-28]。

由于ICG和DNA分子為負(fù)電荷, ICG/DOX的裝載和DNA20包封使得顆粒表面Zeta電位逐步降低。在ICG/DOX-MONs@DNA20顆粒的紅外圖譜上出現(xiàn)酰胺鍵中—C==O—的特征振動(dòng)峰(1640 cm–1)[29],這是由于DNA20包封ICG/DOX-MONs顆粒是通過(guò)DNA20的5’端羧基和ICG/DOX-MONs顆粒表面氨基之間的酰胺化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的, 也證明DNA20的成功包封。另一方面, ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)制備過(guò)程各階段顆粒的紫外–可見(jiàn)光光譜中的特征吸收峰的變化也進(jìn)一步表明ICG/DOX的裝載和DNA包封的成功實(shí)現(xiàn)。同時(shí), 利用紫外–可見(jiàn)光光譜分析計(jì)算, 得到DOX和ICG的裝載量分別為27.2和69.9 μg/mg, 負(fù)載率分別為8.2%和21.0%。

圖1 MONs的形貌、結(jié)構(gòu)表征

(a) SEM image of MONs; (b) TEM images of MONs; (c) DLS particle size distribution of MONs; (d) N2adsorption-desorption isotherm and the corresponding pore size distribution of MONs

2.3 納米遞送系統(tǒng)的光熱性能

因ICG為FDA批準(zhǔn)臨床使用的醫(yī)療診斷菁染料, 具有光熱效應(yīng)。本研究將ICG裝載于納米遞送系統(tǒng), 賦予了納米遞送系統(tǒng)光熱性能。圖3為ICG/DOX-MONs@DNA20顆粒的光熱升溫曲線。

由圖可見(jiàn), 在光功率密度為0.75 W/cm2的近紅外光照射下, 不同濃度的顆粒懸浮液溫度隨濃度增加而升高; 當(dāng)顆粒懸浮液濃度為200 μg/mL時(shí), 近紅外光照射6 min可使懸浮液溫度從26 ℃升至50℃(圖3(a))。另一方面, 在顆粒懸浮液濃度一定的情況下, 懸浮液溫度隨光功率密度增加而升高(圖3(b)), 即調(diào)節(jié)近紅外光的光功率密度可以控制納米遞送系統(tǒng)的升溫情況。因此, ICG的光熱效應(yīng)沒(méi)有因MONs的裝載而失效, ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)的光熱效應(yīng)能滿足光熱治療要求。另一方面, 熱效應(yīng)能夠破壞DNA20與顆粒表面的作用力, 使得DNA20從顆粒表面脫附而打開顆粒的介孔孔道, 實(shí)現(xiàn)DOX和ICG的可控釋放[24]。

圖2 MONs、MONs-NH2、ICG/DOX-MONs和ICG/DOX-MONs@DNA20納米顆粒的(a)Zeta表面電位變化, (b)FT-IR譜圖, 及(c)UV-Vis光譜圖

圖3 (a)不同濃度ICG/DOX-MONs@DNA20懸浮液在0.75 W/cm2的近紅外光照射下的光熱升溫曲線與(b) 100 μg/mL的ICG/DOX-MONs@DNA20懸浮液在不同功率密度的近紅外光照射下的光熱升溫曲線

2.4 納米遞送系統(tǒng)的藥物釋放性能

圖4(a,b)為ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)在37和43 ℃緩沖液中DOX和ICG的釋放曲線。由圖可見(jiàn), 在37和43 ℃的緩沖液中釋放6 h, DOX的釋放量分別為12.3%和52.4%, ICG的釋放量分別為26.4%和71.1%, 表明該納米遞送系統(tǒng)具有明顯的溫度控制釋放性能, 即在43 ℃下可快速釋放DOX和ICG, 而在37 ℃下只能非常緩慢地釋放DOX和ICG。一方面, 這樣的溫度控制釋放可一定程度上防止藥物提前釋放; 另一方面43 ℃也達(dá)到了熱療溫度范圍, 納米遞送系統(tǒng)的光熱效應(yīng)滿足周圍溫度達(dá)到43 ℃, 因而可實(shí)現(xiàn)光熱誘導(dǎo)藥物控制釋放。

因DNA20的5’端羧基與顆粒表面氨基以酰胺鍵結(jié)合, 而其余部分則通過(guò)靜電作用吸附于顆粒表面, 因此小范圍的溫度變化可破壞較弱的靜電作用, 而不影響酰胺鍵結(jié)合[24]。所以通過(guò)小范圍的溫度變化有可能控制DNA20與顆粒表面的靜電作用強(qiáng)弱, 從而實(shí)現(xiàn)DNA20包封介孔孔道的“開啟”和“關(guān)閉”狀態(tài)。圖4(c)為ICG/DOX-MONs@ DNA納米遞送系統(tǒng)在37~43 ℃交替溫度條件下的DOX和ICG釋放曲線。由圖可見(jiàn), 當(dāng)溫度從37 ℃升高到43 ℃并保持1 h, DOX和ICG都出現(xiàn)快速釋放; 當(dāng)溫度從43 ℃降至37 ℃并保持10 h, DOX和ICG的釋放則非常緩慢。重復(fù)升溫和降溫的條件, DOX和ICG的釋放情況呈現(xiàn)相似的趨勢(shì)。因此, ICG/DOX-MONs@ DNA20納米遞送系統(tǒng)可通過(guò)溫度變化實(shí)現(xiàn)可逆的孔道“開啟”和“關(guān)閉”狀態(tài), 更好地控制DOX和ICG的釋放。

2.5 材料的細(xì)胞毒性及細(xì)胞吞噬

圖5為MONs與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)24和48 h后的細(xì)胞毒性。由圖可以看出, MONs與細(xì)胞共培養(yǎng)24 h后, HeLa細(xì)胞活性未受MONs影響, 即使顆粒濃度高達(dá)200 μg/mL, 細(xì)胞存活率仍高達(dá)98.4%。為了觀察MONs在被細(xì)胞吞噬后對(duì)細(xì)胞的毒性影響, 對(duì)與MONs共培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞去除未被吞噬的顆粒, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h后測(cè)定細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示, MONs被細(xì)胞吞噬后繼續(xù)培養(yǎng)24 h, HeLa細(xì)胞的存活率與共培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞存活率都沒(méi)有顯著性差異, 表明細(xì)胞在一定的顆粒濃度下吞噬MONs后不會(huì)對(duì)其細(xì)胞活性產(chǎn)生影響。因此, MONs具有較低的細(xì)胞毒性。

圖4 ICG/DOX-MONs@DNA20在37和43 ℃條件下的(a) DOX和(b) ICG的釋放曲線, 以及(c) ICG/DOX-MONs@DNA20在37和43 ℃交替變溫條件下的DOX和ICG的釋放曲線

圖5 MONs對(duì)HeLa細(xì)胞與不同濃度MONs共培養(yǎng)24和48 h后的細(xì)胞活性情況

腫瘤細(xì)胞吞噬納米遞送系統(tǒng)會(huì)對(duì)后續(xù)治療效果產(chǎn)生重要影響。本研究采用倒置熒光顯微鏡觀察了HeLa細(xì)胞吞噬顆粒的結(jié)果。如圖6所示, 在激發(fā)光照射下的細(xì)胞核因被DAPI染色而發(fā)出藍(lán)色熒光; 因DOX在激發(fā)光照射下發(fā)紅色熒光, 對(duì)于ICG/DOX-MONs和ICG/DOX-MONs@DNA20顆粒, 可觀察到紅色熒光緊密圍繞著細(xì)胞核, 表明HeLa細(xì)胞能夠吞噬ICG/DOX-MONs和ICG/DOX-MONs @DNA20顆粒, 因而使DOX和ICG的腫瘤細(xì)胞內(nèi)遞送成為可能, 從而提高遞送效率和腫瘤治療效果。

2.6 藥物化療–光熱聯(lián)合治療

為了進(jìn)一步評(píng)估ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)的近紅外光照激發(fā)藥物釋放的藥物化療聯(lián)合光熱治療的效果, 以空白組和ICG/DOX-MONs組為對(duì)照組, 分別測(cè)定納米遞送系統(tǒng)與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后在不光照、一次光照和兩次光照條件下HeLa細(xì)胞的存活率。

圖6 HeLa細(xì)胞與不同顆粒共培養(yǎng)3 h后的細(xì)胞吞噬不同顆粒結(jié)果(藍(lán)色: 細(xì)胞核; 紅色: DOX)

如圖7所示, 在無(wú)近紅外光照條件下, ICG/DOX-MONs@DNA20組無(wú)細(xì)胞毒性, 表明納米遞送系統(tǒng)的DNA包封可有效防止DOX大量泄漏; ICG/DOX-MONs組則產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性, 這是由于DOX從顆粒中緩釋而引起細(xì)胞死亡。經(jīng)過(guò)一次近紅外光照后, ICG/DOX-MONs組的細(xì)胞活性下降了25.1%, 而ICG/DOX-MONs@DNA20組的細(xì)胞活性則由94.0%下降至37.4%, 這是由于DNA20包封組在近紅外光照后升高溫度而釋放孔道中的DOX, 從而獲得藥物化療–光熱聯(lián)合治療效果; 而ICG/DOX-MONs顆粒由于提前釋放DOX, 近紅外光照只產(chǎn)生光熱治療效果。經(jīng)過(guò)兩次近紅外光照后, ICG/DOX-MONs組的細(xì)胞活性基本不再下降, 這是由于ICG的光熱不穩(wěn)定性而造成光熱治療失效; ICG/DOX-MONs@DNA20組的細(xì)胞活性仍下降了約17%, 這是由于第二次近紅外光照將繼續(xù)釋放DOX, 而且ICG因MONs保護(hù)而仍然具有光熱效應(yīng), 因而繼續(xù)發(fā)揮藥物化療–光熱聯(lián)合治療效果。以上結(jié)果表明ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)能夠?qū)⑺幬锖凸鉄釀└咝нf送到腫瘤細(xì)胞, 在近紅外光照射下獲得藥物化療–光熱聯(lián)合治療效果。

圖7 HeLa細(xì)胞與ICG/DOX-MONs和ICG/DOX-MONs@ DNA20共培養(yǎng)后在有或無(wú)近紅外光照下的細(xì)胞存活率

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)制備了以二硫鍵橋接的有機(jī)/無(wú)機(jī)雜化MONs為載體共裝載化療藥物DOX和光熱劑ICG, 并以DNA分子包封MONs表面的ICG/DOX- MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)。在近紅外光照射下, ICG/DOX-MONs@DNA20納米顆粒具有光熱效應(yīng), 能夠產(chǎn)生熱量使顆粒周圍溫度達(dá)到光熱治療的溫度要求。另一方面, ICG/DOX-MONs @DNA20納米顆粒在37 ℃條件下僅緩慢釋放DOX和ICG, 而當(dāng)溫度升至43 ℃時(shí)表現(xiàn)出DOX和ICG的快速釋放, 因而具有光熱誘導(dǎo)藥物控制釋放性能。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ICG/DOX-MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)能夠被腫瘤細(xì)胞吞噬, 并且在近紅外光照下顯示出明顯的藥物化療–光熱聯(lián)合治療效果。因此, ICG/DOX- MONs@DNA20納米遞送系統(tǒng)在藥物化療–光熱聯(lián)合治療腫瘤方面具有應(yīng)用前景。

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Preparation of Mesoporous Organosilica-based Nanosystem forSynergistic Chemo- and Photothermal Therapy

ZENG Yulin1,2, CHEN Jiajie1,3, TIAN Zhengfang2, ZHU Min1, ZHU Yufang2,3

(1. School of Materials Science and Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 2. Hubei Key Laboratory of Processing and Application of Catalytic Materials, College of Chemical Engineering, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China; 3. Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200050, China)

Organic-inorganic hybrid mesoporous organosilica has gained more attention in biomedicine due to its high surface area, mesoporous channels, functional framework, and high drug loading capacity. In this study, disulfide- bridged hybrid mesoporous organosilica nanoparticles (MONs) as nanocarriers were employed to construct a nanosystem (ICG/DOX-MONs@DNA20) for delivering drugs and photothermal agents, in which DNA molecules as “switches” were modified on the surface of MONs to control drug release.The results showed that the ICG/DOX-MONs@DNA20nanosystem could increase the temperature to above 43 ℃ for photothermal therapy with near-infrared (NIR) laser irradiation. On the other hand, the ICG/DOX-MONs@DNA20nanosystem exhibited a very slow release of DOX (12.3% in 6 h) at 37 ℃, but a rapid release of DOX (52.4% in 6 h) occurred at 43 ℃. Cell culture experiments indicated that the nanosystem can be internalized by HeLa cells, and exhibited an enhanced therapeutic efficacy of synergistic chemo- and photothermal therapy. Hence, the ICG/DOX-MONs@DNA20nanosystem might be promising for synergistic chemo- and photo-thermal tumor therapy.

mesoporous organosilica; nanocarriers; controlled release; synergistic therapy

TQ174

A

1000-324X(2020)12-1365-08

10.15541/jim20200091

2020-02-24;

2020-03-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(51572172); 上海理工大學(xué)科技發(fā)展項(xiàng)目(2018KJFZ016, 2019KJFZ023)

National Natural Science Foundation of China (51572172); University of Shanghai for Science and Technology (2018KJFZ016, 2019KJFZ023)

曾雨淋(1995–), 女, 碩士研究生. E-mail: 1591422585@qq.com

ZENG Yulin (1995–), female, Master candidate. E-mail: 1591422585@qq.com

朱敏, 副教授. E-mail: mzhu@usst.edu.cn; 朱鈺方, 教授. E-mail: zjf2412@163.com

ZHU Min, associate professor. E-mail: mzhu@usst.edu.cn; ZHU Yufang, professor. E-mail: zjf2412@163.com