魯 陳， 刁 歡， 丁小玲， 代張超， 閆一博， 李呂木*

（1.安徽農業(yè)大學動物科技學院，安徽合肥 230036；2.安徽新華學院藥學院，安徽合肥 230081）

銅是動物的必需微量元素。一系列的試驗證明，飼喂高出需要量的高銅日糧，可促進豬的生長，較為經濟有效的飼喂量為110～250 mg/kg（Ma 等，2015；李永義等，2002；Hill等，2000）。 然而，目前高銅的來源主要是無機硫酸銅，因為其價格便宜。但是豬對其吸收率低，導致糞尿銅排泄多，對環(huán)境污染嚴重（Huang等，2007）?；诖?，我國農業(yè)農村部2009年對飼糧中銅含量進行了限量規(guī)定，限定銅的最高添加量斷奶仔豬為200 mg/kg，生長肥育豬為150 mg/kg，盡量降低殘留和對環(huán)境的污染。與此同時，低殘留的有機銅飼料添加劑先后被開發(fā)出來，如堿式氯化銅 （Guo等，2017）、氨基酸螯合銅 （Jarosz等，2017）、殼聚糖銅（Yue 等，2016）和酵母銅（Lim等，2006）等。但是這些有機銅源生產成本高（Feng等，2014）。因此，研發(fā)既高效又經濟的飼用有機銅添加劑，對促進綠色飼料添加劑的發(fā)展具有重要的現(xiàn)實意義。Fomchenko（2015）等研究發(fā)現(xiàn)，微生物能富集轉化無機銅為微生物有機銅，且具有比表面積大、吸附容量大、操作簡單和成本低等優(yōu)點，因此，微生物有機銅如酵母銅，受到人們的青睞，但這類高銅菌的篩選主要是利用傳統(tǒng)的飼用微生物作為資源進行馴化，通過長時間銅誘導培養(yǎng)來獲得高銅菌，這種獲得性遺傳的遺傳穩(wěn)定性差，易退化，富銅能力也會隨之下降。為此，本研究擬從富銅土壤中篩選高銅菌株，以期獲得將無機銅轉化為微生物有機銅的高效菌株，為養(yǎng)豬生產提供高效廉價的新型有機銅添加劑。

1 材料和方法

1.1 主要儀器 火焰原子吸收光譜儀（德國耶拿分析儀器股份公司，型號：ZEEnit700p）；恒溫搖床（上海三發(fā)科技有限公司，型號：ZHP-250）；烘箱（合肥達斯卡特科學有限公司，型號：DGTG82A）；消化爐（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司，型號：ML-3-4）；pH計 （上海盛磁儀器有限公司，型號：PHS-25）。

1.2 篩選材料和培養(yǎng)基 篩選材料：安徽省銅陵市一廢棄銅礦土壤。

NB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，水 1000 mL，pH 7.2 ～ 7.4；PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，水 1000 mL，pH 7.0 ～ 7.2；固體培養(yǎng)基：由上述的培養(yǎng)基加入2%的瓊脂制成。以上培養(yǎng)基均在121℃，滅菌30 min；含Cu2+培養(yǎng)基：將上述培養(yǎng)基滅菌后，加入無菌的硫酸銅溶液，分別配制濃度為 200、400、600、800 mg/L 和1000 mg/L的5種含Cu2+培養(yǎng)基。

1.3 菌株的分離和篩選

1.3.1 土樣的采集及處理 刮去表層土壤，采集5～10 cm處土樣約100 g于信封中保存?zhèn)溆?。取土?0 g，放入有90 mL無菌水的三角瓶中，振蕩均勻。然后進行10倍梯度稀釋，依次制備10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋度的土壤稀釋液。

1.3.2 富銅菌種的分離和篩選 在無菌條件下吸取0.1 mL相應濃度土壤稀釋液，用涂布平板法涂布分別將細菌和真菌涂布在NB和PDA固體培養(yǎng)基上，NB固體培養(yǎng)基在37℃生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d；PDA固體培養(yǎng)基在30℃生化恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)3 d后觀察，挑取不同形態(tài)單菌落進行純化培養(yǎng)，編號并保存菌種。

將篩選出的菌株涂布到Cu2+濃度為200 mg/L的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，記錄耐受力高的菌株，并將耐受菌株再接種到Cu2+濃度為400 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)觀察。按此方法，依次將耐受菌株接種到Cu2+濃度為600、800、1000 mg/L的培養(yǎng)基進行篩選培養(yǎng)并觀察其生長情況，逐步淘汰耐銅能力差的菌株，篩選出耐受力高的菌株。將耐受力高的菌株進行富銅轉化率的復篩，最后選擇耐銅力高的菌株進行形態(tài)學觀察并送寶生物工程（大連）有限公司進行26S rDNA鑒定并測序，使用 NCBI中的Blast軟件分析菌株測序結果。

1.4 胞內銅含量的測定 稱取0.3 g左右于60℃完全干燥至恒重的菌體于燒杯中，加入10 mL混合酸（硝酸：高氯酸 4:1），置于消化爐上，消化至透亮，冷卻。轉移溶液至50 mL容量瓶中，加去離子水定容，然后用火焰原子分光光度計測量銅離子含量（Jorhem 等，2000）。

1.5 培養(yǎng)條件對無機銅轉化為微生物銅的影響

1.5.1 銅濃度對無機銅轉化為微生物銅的影響將種子液按1%的接種量接種在濃度為2、4、6、8、10 mg/L的PDA液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，30℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng)5 d，三層濾紙過濾收集菌體，用生理鹽水洗三次，菌體置于透析袋中用去離子水透析，直至透析袋外水中無銅離子。于60℃烘箱中烘至恒重，依方法1.4所示測定菌體的胞內銅含量。

1.5.2 菌液接種量對無機銅轉化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L的PDA培養(yǎng)基，將菌液分別按接種量1%、3%、5%、7%、9%（V/V）接種，每組 3個平行，在30℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，測定銅含量。

1.5.3 培養(yǎng)時間對無機銅轉化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L的PDA培養(yǎng)基，將菌液按1%的接種量接種后，在 30 ℃，200 r/min 條件下，放置 2、3、4、5、6、7 d六種不同的培養(yǎng)時間搖瓶培養(yǎng)，每組3個平行試驗，測定銅含量。

1.5.4 培養(yǎng)溫度對無機銅轉化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L的PDA培養(yǎng)基，將菌株按1%的接種量接種后，分別在 26、28、30、32、34 ℃五種不同溫度下，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d，每組3個平行，測定銅含量。

1.5.5 pH對無機銅轉化為微生物銅的影響 在500 mL的錐形瓶中加入200 mL銅含量為2 mg/L，pH 分別為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 的 PDA 培養(yǎng)基，將菌株按1%的接種量接種后，每組3個平行試驗，在30℃，200 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)5 d后，測定銅含量。

1.5.6 正交優(yōu)化培養(yǎng)條件 根據單因素試驗結果，采用 L9（34）正交試驗方法，對溫度（A）、pH（B）、接種量（C）、培養(yǎng)時間（D）4 因素 3 水平進行優(yōu)化。

1.6 轉化率測定 轉化率計算公式如下：

轉化率/%=A/B×100；

式中：A為微生物胞內含銅量，mg；B為培養(yǎng)基中添加的無機銅量，mg。

1.7 數據統(tǒng)計與分析 采用 Microsoft Excel軟件對試驗數據進行初步整理，采用SPSS 20.0軟件對微生物銅轉化率進行單因素方差分析和多重比較，并以鄧肯新復極差法對培養(yǎng)條件進行差異顯著性多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 菌種的鑒定 在高銅土壤中篩選得到31株菌株（表1），其中細菌18株，真菌13株。其中能耐受培養(yǎng)基銅濃度為200 mg/L的菌株有細菌15株，真菌10株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為400 mg/L的菌株有細菌13株，真菌8株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為600 mg/L的菌株有細菌5株，真菌6株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為800 mg/L的菌株有細菌2株，真菌5株；能耐受培養(yǎng)基銅濃度為1000 mg/L的只有真菌4株，細菌均不能耐受。在此4株真菌中，長勢最好的兩株FT5和FT7經鑒定分別為青霉菌和黑曲霉菌。由于前者為非飼用微生物，不再用于后續(xù)研究。

表1 不同菌株對Cu2+的耐受性

耐銅真菌FT7，形態(tài)學觀察菌株頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層梗基和一層小梗，小梗上長有成串褐黑色的球狀，直徑2.5～4.0 μm。分生孢子頭球狀，直徑700～800 μm，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長短不一，頂囊球形，雙層小梗，分生孢子褐色球形。其基因序列已經在Gen-Bank注冊，登陸號為MG712304。

將FT7的測序結果輸入GenBank，并用Blast軟件進行同源性比較，挑選同源性高的菌株及同屬其他種的菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1，與黑曲霉屬的多個菌株具有同源性，與黑曲霉（Aspergillus niger strain JX999490.1）同源性達到100%，說明FT7為黑曲霉。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化 由表2可見，隨著培養(yǎng)基銅濃度逐漸增加，微生物富銅轉化率逐漸降低，培養(yǎng)基銅濃度為2 mg/L時，微生物銅得率最高，為83.53%，培養(yǎng)基銅剩余量為0.33 mg/L，低于0.5 mg/L，達到污水排放標準（GB/T 8978-1996，1996），因此確定培養(yǎng)基銅的濃度為2 mg/L。

由表2可見，接種量會顯著影響轉化率（P<0.05），隨著接種量的逐漸增大，富銅菌的富集轉化率逐漸增加，接種量達3%時，隨著接種量的增加，轉化率達到穩(wěn)定，最大轉化率為84.96%，說明在菌種接種量為3%時，菌種數量和培養(yǎng)基營養(yǎng)物質的量達到最適合的比例，有利于菌體吸收培養(yǎng)基中的銅元素；培養(yǎng)時間也會顯著影響轉化率（P<0.05），隨著培養(yǎng)時間的增加轉化率逐漸增加，當培養(yǎng)5 d時，轉化率達到一個峰值，轉化率為85.14%，隨后隨著時間的增加轉化率達到穩(wěn)定，該結果也說明在菌體培養(yǎng)5 d后，菌體生長增加變緩，生長進入或達到穩(wěn)定期，同時菌體對銅離子的富集達到最佳。

表2 培養(yǎng)基銅濃度、接種量、培養(yǎng)時間、溫度和pH對微生物富銅轉化率的影響

溫度對轉化率具有顯著影響（P<0.05），26～30℃，隨著培養(yǎng)溫度的增加，轉化率逐漸增加，30℃時轉化率達到最大，為85.42%，隨后隨著培養(yǎng)溫度增加，轉化率逐漸降低；培養(yǎng)基初始pH對富集轉化率也具有顯著影響（P<0.05），開始隨著pH逐漸增加，轉化率逐漸增加，當初始pH為5時轉化率最大，為84.94%，隨后隨著pH增加，轉化率逐漸下降。

由表3正交試驗結果可見，對轉化率影響最大的是pH，其次是溫度，最后是時間和接種量，即pH>溫度>時間>接種量。因此得到最優(yōu)組合為A1B2C3D3，即培養(yǎng)溫度29.5℃、pH 5、接種量4%和培養(yǎng)時間5.5 d。驗證該條件下的轉化率為87.65%，高于正交試驗中的所有組合，證明其確為最優(yōu)組合條件。

由表4可知，溫度、pH、接種量和時間都能極顯著影響轉化率（P<0.01），各水平之間差異顯著（P<0.05）。

3 討論

3.1 富銅菌的分離篩選與鑒定 一般在受重金屬污染的地區(qū)都可以篩選到抗重金屬的微生物，這些微生物都通過菌體表面電荷、離子泵、載體協(xié)助、脂類過度氧化和復合物滲透等完成對金屬離子的吸附（Li等，2015；Xia 等，2013），并通過胞外吸附和胞內螯合完成富集 （Anahid等，2011）。因此，本研究以高銅土壤為原料進行富銅微生物篩選，最終篩得一株耐高銅真菌，耐銅量達到1000 mg/mL，說明有針對性的采集樣本，可以提高篩選效率。

表3 正交試驗結果與分析

表4 Duncan’s多重比較

3.2 富銅微生物菌體的洗脫 目前對與洗脫活菌體的緩沖液報道較少，本試驗以上清液中銅的濃度為指標，采用先通過生理鹽水沖洗三遍，然后通過透析袋在去離子水中透析直到上清液中測不出銅離子，對富銅菌體進行洗脫，以洗掉菌體表面吸附不牢固的無機銅，確保得到都是微生物銅。菌體在吸附金屬離子的過程中，金屬銅離子通過與細胞表面特別是與細胞壁結構（蛋白質、多糖、脂類等）中的化學基團（如羧基、羥基、磷?；?、酰胺基、硫酸脂基、氨基、硫基等）的相互作用，吸附螯合到細胞表面（陳燦等，2006）。與同類其他文章通過EDTA緩沖液洗脫菌體相比，EDTA緩沖液螯合能力強，會去除螯合細胞壁上的金屬銅。本試驗采用的洗脫方法能更好地保留螯合在細胞表面的銅離子，可以獲得更多的有機銅。

3.3 培養(yǎng)條件優(yōu)化 菌液的接種量過多或過少都會影響轉化率，本試驗中，接種量過低（1%）時，銅轉化率低，接種量逐漸增加達到一定量 （3%）時，轉化率逐漸升高并達到穩(wěn)定。這可能是由于Cu2+的濃度一定時，菌體數量增加，活性吸附點增多，菌體表面與金屬離子接觸和結合的機會也增加，必然有更多的Cu2+被吸附，相應地使Cu2+的吸附率增大；但超過一定范圍后，隨著菌體數量的增加，菌體細胞之間兩性基團的相互結合作用不斷增加，占據了部分有效的結合位點 （林海等，2013）。因而當菌液接種量一定時，轉化率不會隨著菌液添加量的增大而增大（∨Sillerová等，2012）。

培養(yǎng)溫度不僅對微生物的生長和新陳代謝有影響，而且影響微生物細胞內酶的活性。因此，不同微生物富集轉化銅的溫度都不一樣，如假單胞菌USTB-E，在溫度為35℃時富集性能最好（王海鷗等，2011）。本試驗獲得的黑曲霉FT7最佳富集轉化率溫度為29.5℃，說明溫度過高可能導致菌株內酶的活性降低甚至喪失，影響菌株的生長代謝，造成菌株FT7轉化率低。溫度過低，菌株生長緩慢并導致體內酶活性降低，從而減少菌體內代謝產物的生成和積累，降低微生物銅產生，減少積累量，降低轉化率。

pH對微生物的生長影響顯著，因為微生物生長過程中機體內發(fā)生的大多數酶促反應都需要一個適宜的pH范圍，只有在合適的pH范圍內，酶促反應的速率才會達到最高，低于或者高于這個范圍，微生物的生長就會受到抑制。pH通過影響細胞質膜的通透性、膜結構的穩(wěn)定性、物質的溶解性和表面電荷氧化還原電位來影響營養(yǎng)物質的吸收，從而影響物生物的生長速率（Liu等，2014；葉錦韶等，2011）。本試驗初始pH為5時，轉化率最大，為84.94%，隨后隨著pH的增加轉化率下降，pH低于5時，隨著pH的增加而轉化率增加，說明該菌在堿性環(huán)境下轉化率較差，在弱酸性條件下有較高富銅轉化率。

4 結論

從高銅土壤中篩選得到一株真菌FT7，經分子生物學鑒定為黑曲霉。在銅濃度為2 mg/L的條件下，菌株FT7轉化銅的最佳培養(yǎng)條件為溫度29.5℃、pH 5、接種量4%和培養(yǎng)時間5.5 d，該條件下其轉化率可達87.65%。