吳海港 ， 張夢瑤 ， 胡玉妍 ， 陳瀟欽 ， 劉 佳 ， 劉錦妮 *

（1.信陽農林學院牧醫(yī)工程學院，河南信陽 464000；2.信陽市獸藥新制劑研發(fā)與創(chuàng)制工程技術研究中心，河南信陽 464000）

苦參堿是從豆科的槐屬、野決明屬及山豆根屬等植物提取的生物堿?？鄥A具有多種生物活性，對機體多種器官具有調節(jié)作用，同時具有抗寄生蟲、抗細菌、抗真菌及抗病毒等藥理作用（吳富鑫等，2019；張明發(fā)等，2018），在畜牧生產中具有廣泛的推廣應用價值。冷曉紅（2013）、韓歡勝等（2017）采用苦參堿治療奶牛乳房炎取得了較好的臨床效果。胡安君等（2016）報道苦參堿對PRRSV有顯著抑制作用，可用于豬繁殖與呼吸障礙綜合征的治療。 Raza（2015）和 Kostadinovic等（2015）使用苦參堿治療家禽新城疫及球蟲病，治療效果顯著。

苦參堿在眾多方面具有較好的生物活性，但是一些研究發(fā)現(xiàn)大劑量使用苦參堿可能引起中毒癥狀，主要以急性肝毒性、神經毒性、胃腸道反應為主，此外還可引起呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)毒性等。研究表明，苦參堿可提高中樞神經的興奮性遞質谷氨酸水平，降低抑制性遞質γ-氨基丁酸水平，還可抑制膽堿酯酶活性造成膽堿能神經興奮，是引起癲癇樣發(fā)作的生物化學機制 （梁培等，2015）。張茜等（2011）試驗結果表明，苦參堿和氧化苦參堿可能對正常的肝細胞具有一定的毒性作用。楊良月（2015）對綿羊的毒理學試驗表明，大劑量使用苦參堿可造成肺臟、肝臟、腦、腎臟和心臟損傷。因此，開展苦參堿安全性評價對苦參堿在畜牧生產中的應用推廣至關重要。本試驗對苦參堿的急性毒性及對血液生理生化指標影響進行初步評價，為下一步苦參堿的推廣和研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 小鼠，雌雄各半，96只，體重（25±2）g，動物分籠飼養(yǎng)于信陽農林學院養(yǎng)殖基地，標準飼料喂養(yǎng)，自由攝食和飲水，室溫（22±2）℃，濕度（70±5）%。

1.2 主要藥品與設備 苦參堿 （含量≥98%，陜西滕邁生物科技有限公司提供）；邁瑞B(yǎng)C-2600全自動血細胞分析儀 （武漢凱典瑞醫(yī)療科技有限公司）；Animal-3000型動物生化分析儀 （濟南格利特科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 半數(shù)致死量的測定 預試驗：在實驗室中，將溫度控制在（22±2）℃，試驗時，應提前禁食 12 h，禁水2 h。然后，取小鼠20只，隨機平均分成5組，分別按不同劑量灌胃給藥，給藥后，給予其正常飲水和進食，確定其絕對致死劑量與最大耐受劑量，為正式試驗做準備。

正式試驗：在實驗室中，將溫度控制在（22±2）℃，試驗時，應提前禁食12 h，禁水2 h。然后，取小鼠40只，隨機平均分5組，根據(jù)一定的組間劑量比，每組按一定的劑量采用灌胃給藥。給藥后，給予其正常飲水和進食，并連續(xù)觀察5 d。隔一定時間觀察并記錄小鼠的癥狀、生理狀態(tài)和死亡情況，根據(jù)每組死亡數(shù)量，最后算出半數(shù)致死量（改良寇氏計算法）。

1.3.2 血常規(guī)指標和血液生化指標的測定 選用健康、體重均勻的小鼠36只，隨機均分成4組，根據(jù)半數(shù)致死量結果，分高、中、低（5、2、0.5 mg/mL）三個劑量組對小鼠進行灌胃給藥，對照組以等量生理鹽水進行灌胃。每天給藥一次，每次每只灌胃0.5 mL，連續(xù)灌胃14 d。每天觀察并記錄小鼠健康狀況，活動、采食、飲水、排泄物、發(fā)病和死亡等。分別于第7天和第14天采用眼眶采血法進行采血，進行血液生理和生化檢測。

檢驗項目包括：紅細胞（RBC）、白細胞（WBC）、紅細胞壓積（HCT）、血紅蛋白（HGB）、血小板總數(shù)（PLT）等血常規(guī)指標和丙氨酸轉移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALKP）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）、總蛋白（TP）、血糖（GLU）等血液生化指標。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析 采用SPSS 18.0進行單因素方差分析，用LSD法進行多重比較，結果均以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 急性毒理試驗結果 小鼠試驗觀察結果表明，高劑量組（500 mg/kg）灌胃 3 min后，神經癥狀，四肢無力，精神不濟，出現(xiàn)抽搐倒地，全身震顫；約5 min后全部死亡。350、245、171.5 mg/kg劑量組小鼠灌胃后3～5 min均出現(xiàn)肌肉抽搐，亂跑亂跳，痙攣，鉆地扎堆等現(xiàn)象。120.05 mg/kg劑量組灌胃給藥后出現(xiàn)輕微神經癥狀，輕度肌肉抽搐，精神沉郁，身體蜷縮，鉆地扎堆，約2 h后精神恢復正常，未有死亡狀況出現(xiàn)（表1）。未死亡小鼠1 d后精神活動均恢復正常?？鄥A經口灌服半數(shù)致死量LD50為245.0191 mg/kg，其95%置信區(qū)間為201.56 ～297.92 mg/kg。

表1 苦參堿對小鼠急性毒性試驗結果

2.2 苦參堿對小鼠血常規(guī)指標和血液生化試驗結果

2.2.1 苦參堿對小鼠血液生理學試驗結果 由表2可知，給藥7 d后，與對照組相比，各試驗組中白細胞總數(shù)、淋巴細胞、中間細胞和血小板總數(shù)降低，差異顯著（P＜0.05），粒細胞、紅細胞總數(shù)和血紅蛋白數(shù)量升高，差異顯著（P＜0.05）。其中中劑量組中各項指標升高或者降低程度最為明顯。各試驗組相比，中劑量組中白細胞總數(shù)、淋巴細胞和中間細胞數(shù)量顯著低于低劑量組和高劑量組（P＜0.05），而低劑量組和高劑量組中各項指標差異不顯著（P＞0.05）。給藥14 d后，各試驗組中血小板數(shù)量降低最明顯。低劑量組血液中白細胞總數(shù)、中間細胞、粒細胞顯著高于對照組（P＜0.05），而淋巴細胞、紅細胞總數(shù)、血紅蛋白和血小板總數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05）。 中劑量組血液中各項指標顯著低于對照組（P＜0.05）。和第7天相比，低劑量組中白細胞總數(shù)、淋巴細胞、中間細胞、粒細胞顯著升高，紅細胞總數(shù)、血紅蛋白和血小板總數(shù)顯著降低（P＜0.05），而中劑量組和高劑量組中各項生理指標總體呈降低趨勢。

2.2.2 苦參堿對小鼠血液生化學試驗結果 由表3可知，給藥7 d后，中劑量組和高劑量組中ALKP、UREA、TP含量較對照組顯著增高 （P＜0.05），其中高劑量組中ALKP和TP分別是對照組的1.96倍和2.18倍。ALT和GLU含量低于對照組，差異顯著（P＜0.05）。低劑量組中除CREA和TP外，其他各項指標顯著降低（P＜0.05）。各試驗組相比，中劑量組中各項指標變化最為明顯。給藥14 d后，各試驗組中ALKP和GLU含量顯著低于對照組（P＜0.05），低劑量組和中劑量組中ALT、UREA、CREA、TP 的 含量 顯著升高 （P ＜0.05）。各試驗組相比，高劑量組中各項指標呈下降趨勢，其中ALKP和CREA含量差異顯著（P＜0.05）。 和第 7天相比，血清中 ALKP、GLU、TP 呈下降趨勢，ALT、CREA、UREA呈升高趨勢。

表2 苦參堿對小鼠血液生理指標的影響

表3 苦參堿對小鼠血液生化指標的影響

3 討論

急性毒性試驗是評價藥物及其制劑安全性的重要指標，可以根據(jù)急性毒性試驗結果判斷藥物的毒性大小及其作用的靶器官，并且為亞急性、慢性毒性試驗設計提供依據(jù)。LD50是評價急性毒性的重要指標。楊良月等（2015）報道，苦參堿小鼠灌胃的LD50為570.26 mg/kg，其95%置信區(qū)間為487.45 ～ 635.78 mg/kg。 張宏利等（2005）研究表明，苦參堿小鼠灌胃的LD50為64 mg/kg。貝宇飛等 （2012）對小鼠腹腔注射苦參堿得出的LD50為92.56 mg/kg。本試驗結果顯示，苦參堿小鼠灌胃的LD50為 245.0191 mg/kg，其 95%置信區(qū)間為201.5580～297.9202 mg/kg。表明藥物LD50大小與給藥途徑、劑型、藥物純度等因素有關。此外，本試驗過程中發(fā)現(xiàn)小鼠灌服苦參堿后，大部分小鼠會出現(xiàn)強直性痙攣，肌肉震顫等毒性反應，時而會出現(xiàn)上竄下跳，身體蜷縮，喜扎堆等反應，可見苦參堿毒性會作用于神經系統(tǒng)。這與田雪松等（2016）報道結果相一致，其原因可能是由于大量使用苦參堿后，會抑制體內膽堿酯酶的活性。

血液生理指標、生化指標是評價機體和組織器官病變的重要指標。丙氨酸轉移酶和堿性磷酸酶是評價肝是否損傷的指標，肌酐和尿素是評價腎是否損傷的指標?？偟鞍住⒀强煞从丑w內蛋白質含量與血液中葡萄糖濃度（戴五好等，2015）。本試驗結果顯示，使用苦參堿能夠提高血液中紅細胞、粒細胞的數(shù)量，減少血小板總數(shù)，且與藥物濃度呈負相關，與用藥次數(shù)呈正相關。此外，剖檢小鼠發(fā)現(xiàn)，體內組織中有大量充血和出血現(xiàn)象，表明苦參堿產生的毒性反應會引起小鼠體內產生炎癥或局部感染，這和宋兵（2009）、劉學楠等（2019）報道的苦豆子提取物的毒性相似。 研究表明，苦參堿能夠顯著升高血清ALT、AST含量，降低SOD、MDA、GSH 含量，導致肝毒性（郭秋平，2016；李素君，2011）。本試驗結果顯示，給藥7 d后，中劑量組和高劑量組中 ALKP、UREA、TP含量顯著增高，ALT和GLU含量呈下降趨勢，而給藥14 d后，各試驗組中ALKP和GLU含量下降，ALT、UREA、CREA、TP的含量升高。表明苦參堿能夠引起肝臟和腎臟毒性，其呈現(xiàn)毒性-時間-濃度正相關。這與李素君（2011）的試驗結果相一致，說明苦參堿毒性靶器官主要是肝臟、腎臟和神經系統(tǒng)。其毒性機制有待進一步研究。

4 結論

本試驗結果表明，苦參堿經口灌服半數(shù)致死量 LD50為 245.0191 mg/kg，其 95%置信區(qū)間為201.5580～297.9202 mg/kg，屬中等毒性物質?？鄥A能夠升高血液中紅細胞、粒細胞的數(shù)量，降低血小板總數(shù)。 血清中 ALKP、GLU、TP、ALT、CREA、UREA總體呈現(xiàn)升高趨勢，且與藥物劑量、給藥時間呈正相關。