王靖國(guó)綜述， 付 錦審校

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種經(jīng)典的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，主要以大腦皮質(zhì)、皮質(zhì)下白質(zhì)、腦干、小腦、視神經(jīng)和脊髓等部位的病變?yōu)樘攸c(diǎn)。MS是導(dǎo)致年輕人神經(jīng)性(非創(chuàng)傷性)殘疾的首要病因，全球約有二百萬(wàn)人患病，歐美國(guó)家發(fā)病率較高，且最近幾年來(lái)有上升的趨勢(shì)[1]。由于該病的發(fā)病機(jī)制尚未被闡明，目前罹患MS的患者還無(wú)法被完全治愈。早期準(zhǔn)確診斷并在緩解期選擇合適的疾病修正治療(disease-modifying treatment,DMT)是延緩疾病進(jìn)展并降低致殘率的重要手段。

近年來(lái)，微小RNA(microRNA,miRNA)作為一種能夠在體液中穩(wěn)定表達(dá)的分子且與多種疾病密切相關(guān)，逐漸被研究人員認(rèn)為是一種潛在的疾病生物學(xué)標(biāo)志物。miRNA主要通過(guò)靶向作用于相關(guān)基因并調(diào)控其表達(dá)水平，進(jìn)而參與了包括MS在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與發(fā)展。大量研究發(fā)現(xiàn)，MS患者中循環(huán)miRNA的表達(dá)水平不僅與健康人群存在差異，而且隨著疾病的進(jìn)展以及在不同藥物治療前后也出現(xiàn)了明顯的變化。因此，循環(huán)miRNA作為一種潛在的MS生物學(xué)標(biāo)志物而受到了越來(lái)越多的關(guān)注。

為了全面總結(jié)循環(huán)miRNA表達(dá)水平與MS患者臨床特征之間的關(guān)系，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其中具有重要價(jià)值的miRNA，本文主要圍繞MS與循環(huán)miRNA在診斷、預(yù)后及療效評(píng)估方面的關(guān)系進(jìn)行綜述。

1 MS的診斷及預(yù)后研究現(xiàn)狀

現(xiàn)階段MS的診斷主要依賴于對(duì)可疑患者神經(jīng)系統(tǒng)癥狀和體征的觀察，同時(shí)借助其它輔助手段如腦和脊髓的核磁共振成像、腦脊液(cerebrospinal fluid,CSF)的實(shí)驗(yàn)室檢查以及神經(jīng)電生理檢查等。2017年McDonald診斷標(biāo)準(zhǔn)以及2018年版多發(fā)性硬化診斷和治療中國(guó)專家共識(shí)對(duì)原有的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了一定的修改，在臨床孤立綜合征(clinically isolated syndrome,CIS)患者和經(jīng)MRI證實(shí)的空間多發(fā)性損傷的患者CSF中，若出現(xiàn)CSF特異性寡克隆帶(oligoclonal bands,OB)也被認(rèn)為是時(shí)間多發(fā)性損傷特點(diǎn)之一，并支持做出MS的診斷[2,3]。因此，OB也是人體體液中第一種被廣泛應(yīng)用于臨床的診斷性生物學(xué)標(biāo)志物。新標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)化了血清學(xué)檢查在診斷過(guò)程中的作用，使得MS的診斷時(shí)間進(jìn)一步縮短[4]。由此可見，通過(guò)對(duì)CSF或其他體液中的生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)等輔助手段將會(huì)在MS的早期診斷過(guò)程中扮演越來(lái)越重要的角色。大量研究表明，患者的臨床特征，諸如年齡、性別、種族及發(fā)作頻率等因素是復(fù)發(fā)緩解型MS(relapsing remitting multiple sclerosis,RRMS)的疾病活動(dòng)性預(yù)測(cè)因子[5,6]。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)血清及CSF中的神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白(neurofilament light protein,NFL)表達(dá)水平與頭部核磁檢查顯示的腦損傷程度顯著相關(guān)，即伴有影像學(xué)進(jìn)展的MS患者血清中NFL水平顯著高于處于緩解期或核磁下未見新發(fā)損傷灶的MS患者血清中NFL的表達(dá)水平[7]。由此可見，通過(guò)檢測(cè)人體體液中的特定分子物質(zhì)的表達(dá)水平，對(duì)患者進(jìn)行診斷及預(yù)后評(píng)估將成為將來(lái)MS相關(guān)研究的重點(diǎn)方向之一。因此，尋找并驗(yàn)證可靠而實(shí)用的特異性生物學(xué)標(biāo)志物對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)MS患者，選擇合理的治療手段及改善預(yù)后具有重要的意義。

2 循環(huán)miRNA的產(chǎn)生及其生物學(xué)特點(diǎn)

微小RNA(microRNA,miRNA)是一種長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸單位的單鏈非編碼RNA，于1993年由Lee等人在線蟲中首次發(fā)現(xiàn)[8]。miRNA主要在基因的轉(zhuǎn)錄后階段發(fā)揮作用，調(diào)控靶基因的表達(dá)水平。人類基因組序列中共含有約2000個(gè)編碼miRNA的基因，在RNA聚合酶Ⅱ(RNAP Ⅱ)和核糖核酸酶(RNase)的作用下，miRNA在細(xì)胞核中合成并加工成為前體miRNA(pre-miRNA)，后經(jīng)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送至細(xì)胞核外，經(jīng)另一種核糖核酸酶剪切修飾后產(chǎn)生成熟的miRNA，隨后與AGO蛋白結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex,RISC)，并與特定mRNA的3’UTR區(qū)結(jié)合抑制靶基因的表達(dá)[9]。miRNA在諸如免疫調(diào)節(jié)、代謝控制、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞增殖與分化等多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]。

近年來(lái)國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究結(jié)果已經(jīng)證明，miRNA參與了MS的啟動(dòng)與發(fā)展[11]。Yang等通過(guò)對(duì)公開的基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了綜合分析發(fā)現(xiàn)：與健康對(duì)照組相比，45個(gè)miRNAs和621個(gè)靶mRNAs在MS患者中異常表達(dá)。并通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-PCR,RT-PCR)檢測(cè)了MS患者與健康對(duì)照組的全血樣本發(fā)現(xiàn)hsa-miR-328-3p在MS患者中顯著上調(diào)，而其靶基因RAC2具有下調(diào)趨勢(shì)[12]。隨著研究的深入，一些重要的miRNA在MS發(fā)病過(guò)程中的某些具體機(jī)制也開始被逐漸闡明。Angelou等人在自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，受抗原刺激后的幼稚CD4+T細(xì)胞在向Th17細(xì)胞分化的過(guò)程中，let-7的表達(dá)水平出現(xiàn)下調(diào)。Let-7是Th17細(xì)胞增殖過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子，可負(fù)性調(diào)控細(xì)胞因子受體編碼基因Ⅱ1r1和Il23r，并阻止Th17細(xì)胞向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，進(jìn)而延緩EAE小鼠癥狀進(jìn)展[13]。與此同時(shí)，一種細(xì)胞外的游離miRNA：循環(huán)miRNA逐漸成為miRNA研究的新方向之一。

循環(huán)miRNA廣泛分布于人類體液，包括血液、CSF、尿液及腹水中，因其多存在于各類膜性囊泡中，因此無(wú)法被RNase酶降解，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[14]。特別是外泌體相關(guān)miRNA作為一種近幾年研究較為深入的循環(huán)miRNA之一，其生物學(xué)功能及潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值逐漸受到研究者們的關(guān)注。外泌體是由細(xì)胞分泌的直徑約50～150 nm的膜性囊泡，包裹多種分子如蛋白質(zhì)、DNA、RNA和脂質(zhì)等[15]。由于血液中循環(huán)外泌體具有其母體細(xì)胞的生物學(xué)印記，可以反映包括癌癥與神經(jīng)退行性疾病在內(nèi)的多種疾病的狀態(tài)，因此能夠作為一種非侵入性檢查的檢測(cè)對(duì)象[16]。還有研究人員將轉(zhuǎn)染了編碼增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,eGFP)的質(zhì)粒的細(xì)胞射到小鼠體內(nèi)時(shí)，發(fā)現(xiàn)攜帶eGFP RNA的外泌體不僅存在于小鼠外周血中，也出現(xiàn)在多種類型的細(xì)胞內(nèi)，表明循環(huán)miRNA具有通過(guò)外泌體與介導(dǎo)細(xì)胞間信號(hào)交流的作用[17]。以上研究結(jié)果均表明，循環(huán)miRNA不僅可以在細(xì)胞內(nèi)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，也可以被分泌到細(xì)胞外并作用于其它類型的細(xì)胞，參與維持機(jī)體免疫學(xué)功能穩(wěn)態(tài)。正是由于循環(huán)miRNA所具有的穩(wěn)定性和疾病特異性，越來(lái)越多的研究人員將其作為疾病特異性生物學(xué)標(biāo)記物的理想來(lái)源之一。近年來(lái)關(guān)于循環(huán)miRNA與MS的研究日趨增加，在患者體液中，尤其是外周血及CSF中有越來(lái)越多的疾病相關(guān)的循環(huán)miRNA被發(fā)現(xiàn)。

3 循環(huán)miRNA與MS相關(guān)研究進(jìn)展

3.1 診斷相關(guān)性循環(huán)miRNA 大量實(shí)驗(yàn)研究表明，與健康人群相比，miRNA在MS患者體液中存在異常表達(dá)。Vistbakka等人運(yùn)用RT-PCR方法定量分析了83例進(jìn)展型MS患者及正常人群血清中miRNA的表達(dá)情況(31例診斷為原發(fā)進(jìn)展型，31例診斷為繼發(fā)進(jìn)展型，21例作為正常對(duì)照組)[18]。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，原發(fā)進(jìn)展型MS患者血清中有5種miRNA(miR-128-3p、miR-376c-3p、miR-26a-5p、miR-191-5p及miR-24-3p)的表達(dá)明顯升高，其中3種miRNA(miR-376c-3p、miR-26a-5p、miR-191-5p)在繼發(fā)性進(jìn)展MS患者的血清中亦明顯升高，可能是MS患者診斷的生物學(xué)標(biāo)志物。該研究還發(fā)現(xiàn)，在MS組中，miR-124-3p表達(dá)量與首次癥狀持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)(P=0.03)。不僅如此，Selmaj等人結(jié)合二代測(cè)序技術(shù)和數(shù)字化定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)對(duì)101名RRMS患者及51名健康對(duì)照的血清外泌體進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)4種循環(huán)miRNA(miR-122-5p、miR-196b-5p、miR-301a-3p及miR-532-5p)在RRMS患者發(fā)作期顯著降低，可能與MS患者的活動(dòng)性及臨床發(fā)展相關(guān)[19]。

3.2 預(yù)后相關(guān)性循環(huán)miRNA 循環(huán)miRNA在對(duì)MS進(jìn)行臨床分型及嚴(yán)重程度的評(píng)估方面也具有潛在價(jià)值。Gandhi等人通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，血清中miR-92a-1在復(fù)發(fā)緩解型與繼發(fā)進(jìn)展型患者之間存在差異表達(dá)，并且與MS患者的擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(extended disability status scale,EDSS)評(píng)分(P=0.002)及單次病程持續(xù)時(shí)間(P=0.003)密切相關(guān)[20]。另一項(xiàng)研究分析了循環(huán)miRNA與MS患者影像學(xué)表現(xiàn)之間的關(guān)系。該項(xiàng)研究納入了120位MS患者，并對(duì)他們進(jìn)行腦及脊髓的核磁共振檢查。結(jié)果表明，部分血清miRNA的表達(dá)水平與組織損傷程度和腦萎縮程度顯著相關(guān)，可用于監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。此外，miRNA可能對(duì)MS發(fā)病具有保護(hù)作用，miR-143-3p、miR-142-5p和miR-181c-5p的表達(dá)水平與MS患者的腦萎縮程度呈負(fù)性相關(guān)[21]。有趣的是，研究人員還發(fā)現(xiàn)與正常人相比，miR-143-3p和miR-142-5p的表達(dá)水平在罹患阿爾茲海默病的患者血漿及CSF中同樣下調(diào)，表明這兩種miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病過(guò)程中可能具有協(xié)同作用。而在miR-92a-3p上調(diào)表達(dá)的樣本中則呈現(xiàn)出更加嚴(yán)重的影像學(xué)表現(xiàn)，且在MS患者的血漿與B細(xì)胞中，miR-92a-3p的表達(dá)水平均高于健康對(duì)照，因此研究人員認(rèn)為它是一種致病性miRNA[22,23]。由此可見，miRNA是MS患者的潛在預(yù)后型生物標(biāo)志物，可作為疾病發(fā)展的致病性或保護(hù)性評(píng)定指標(biāo)。

3.3 循環(huán)miRNA在MS治療效果評(píng)估中的作用 如今，針對(duì)MS患者緩解期的DMT藥物越來(lái)越豐富，但由于患者多變的臨床表現(xiàn)和反復(fù)發(fā)作的病程，因此在治療藥物選擇和預(yù)后評(píng)估中存在較大困難。迄今為止，尚且缺乏一種能有效反映MS緩解期藥物治療效果的血清學(xué)檢查，而循環(huán)miRNA作為一種在人體體液中穩(wěn)定存在的潛在生物學(xué)標(biāo)志物而被深入研究。例如，干擾素β(interferon-beta,IFN-β)作為MS緩解期治療的一線藥物，在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能、抑制外周血T細(xì)胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)揮著重要作用[24,25]。最近的一項(xiàng)研究分析了接受IFN-β治療的MS患者與首次確診且未經(jīng)治療的患者血清外泌體中miRNA的表達(dá)譜差異，結(jié)果表明，有16個(gè)miRNA差異表達(dá)。其中，miR-22-3p和miR-660-5p在治療后的患者體內(nèi)上調(diào)表達(dá)，14個(gè)miRNA下調(diào)表達(dá)，包括調(diào)節(jié)髓鞘合成的miR-23a-3p、與神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)的let-7b-5p、以及參與炎癥反應(yīng)的miR-15b-3p、miR-223-3p等，而其中大部分的差異表達(dá)miRNA在以往的研究中被證明是潛在的MS診斷性生物學(xué)標(biāo)志物[26]。同樣在MS患者的血清中，Ebrahimkhani等人發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)過(guò)芬戈莫德治療6個(gè)月后，有兩種miRNA表達(dá)下調(diào)(miR-150-5p及miR-548e-3p)，而有3種miRNA表達(dá)上調(diào)(miR-130b-3p、miR-654-5p及miR-487b-3p)[27]。不僅如此，研究人員在經(jīng)過(guò)DMT治療的MS患者尿液、CSF等體液中也發(fā)現(xiàn)了大量差異表達(dá)的miRNA[28]。上述結(jié)論表明MS患者在接受一段時(shí)間的DMT治療之后，其體液內(nèi)部分循環(huán)miRNA會(huì)出現(xiàn)顯著變化，且與治療后疾病進(jìn)展情況相關(guān)，可能是評(píng)價(jià)MS患者治療效果的生物學(xué)標(biāo)志物。

4 總結(jié)與展望

循環(huán)miRNA是一種在體液中穩(wěn)定存在的生物學(xué)標(biāo)志物，如果能對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確而快速的定量分析，將在MS的診斷、治療及預(yù)后判定方面具有良好的應(yīng)用前景。然而，由于其在MS發(fā)病過(guò)程中的具體分子機(jī)制尚不明確，且技術(shù)上對(duì)其進(jìn)行精確定量分析存在困難，故將其投入臨床應(yīng)用仍需時(shí)日。因此，在今后的研究中還需要借助多種手段對(duì)它們之間的關(guān)系展開全面而深入的分析，并根據(jù)所得到的結(jié)果對(duì)其中幾個(gè)有重要意義的miRNA進(jìn)行更進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)驗(yàn)證。