盧增珍，劉國濤，郭燕玲，劉 鵬，盧慶威，王 軍

糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥（diabetes lower extremity arteriosclerosis obliterans, DLASO）是糖尿病足潰瘍難愈和截肢高風(fēng)險的主要原因，腔內(nèi)介入治療是目前治療首選方案，但術(shù)后再狹窄發(fā)生給臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)，再狹窄發(fā)生與術(shù)后血管內(nèi)皮損傷，局部炎癥反應(yīng)，血管平滑肌細胞增殖、移行及內(nèi)膜增生等相關(guān)[1]。血管再狹窄發(fā)生與炎癥因子具有相關(guān)性，通過針對炎癥因子的治療可防治術(shù)后血管再狹窄[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯能抑制炎癥因子的釋放、降低致纖維化因子TGF-β表達，對糖尿病大血管纖維化有改善作用，其中桃仁能降低TRIB3 mRNA及TLR4 mRNA表達[3-5]。本研究擬通過體外細胞實驗探究桃核承氣湯含藥血清對損傷血管內(nèi)皮細胞炎癥因子及TLR4、TRIB3表達的影響，為中醫(yī)藥防治DLASO血管再狹窄提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物與細胞 8周齡雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量（200±20）g，購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心，動物合格證號SCXK（京）2017-0005。大鼠主動脈血管內(nèi)皮細胞株購于北納生物科技有限公司（編碼BNC337896）。

1.2 藥物 桃核承氣湯（桃仁12 g，大黃12 g，桂枝9 g，炙甘草6 g，芒硝6 g，以上藥物為顆粒劑，由四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)，批號19016264）。顆粒劑溶于蒸餾水，加熱融化，含有效藥物原生藥材濃度為4.5 g/mL，即配即用，常溫灌胃。0.9%氯化鈉溶液，國藥準字：H37022336，山東辰欣藥業(yè)股份有限公司。

1.3 主要試劑與儀器 脂多糖（LPS）購于sigma公司，貨號L2880；BI胎牛血清 GIBCO，貨號04-102-1A；DMEM高糖培養(yǎng)基，貨號C11960500BT；Hycllone雙抗，貨號15140-122。PCR引物由武漢賽維爾生物科技有限公司合成（引物序列見表1）；熒光定量PCR儀（7500 FAST Real-Time PCR System）為美國Thermo公司產(chǎn)品；酶標檢測儀（KHB ST-360）為上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司。

1.4 含藥血清制備 將30只SD大鼠隨機分為生理鹽水組（n=15），桃核承氣湯組（n=15）。根據(jù)成年人和大鼠體表面積轉(zhuǎn)換公式，大鼠等效劑量約為成年人的6.3倍。桃核承氣湯組予灌胃1 mL/(100 g·d)顆粒劑，生理鹽水組予等體積0.9%氯化鈉溶液灌胃，予每日定時（8時、16時）灌胃，連續(xù)7 d，于第7天最后一次灌胃1 h后取大鼠腹主動脈血，室溫下靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，分離血清，56 ℃恒溫水滅活30 min，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫幯逯苽鋮⒖纪踔靖遊6]制備方法。

1.5 細胞培養(yǎng) 大鼠主動脈內(nèi)皮細胞株置于DMEM高糖培養(yǎng)基(10%胎牛血清+1%青霉素/鏈霉素)于5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。

1.6 分組與干預(yù) 將細胞傳代培養(yǎng)，生長融合成單層細胞，胰酶消化并計數(shù)，接種于96孔板（每孔3×104個細胞），24 h后傾去培養(yǎng)液，PBS清洗2～3遍，將細胞隨機分為4組，正常組、正常加藥組、模型組、模型加藥組。分別用生理鹽水組大鼠血清（89%培養(yǎng)液+10%大鼠血清+1%青霉素/鏈霉素），桃核承氣湯組大鼠含藥血清（10%），LPS（1 μg/mL）+生理鹽水組大鼠血清（10%），LPS（1 μg/mL）+桃核承氣湯組含藥血清（10%）干預(yù)細胞。

1.7 ELISA 法檢測IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白表達水平 將主動脈內(nèi)皮細胞種于6孔板中，每孔6×105個細胞，根據(jù)實驗分組情況予以相應(yīng)因素處理，在干預(yù)48 h后收集各組細胞上清液，按ELISA試劑盒說明書步驟分別進行IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白檢測的含量。

1.8 qPCR檢測IL-1β、IL-6、TGF-β、TRIB3、TLR4的mRNA表達 將主動脈內(nèi)皮細胞種于6孔板中，每孔6×105個細胞，根據(jù)實驗分組予以相應(yīng)因素處理，培養(yǎng)48 h后，按試劑盒說明操作，分別提取各組細胞株的總RNA，以提取的RNA為模板，按qPCR試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 15 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，40循環(huán)。將擴增的cDNA加入至20 μL反應(yīng)體系。引物序列見表1。

熒光定量PCR循環(huán)溫度為：94℃ 4 min, 94℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 30 s 40 個循環(huán)，然后 65 ℃ 5 s、95 ℃ 5 min。以β-actin 作為內(nèi)參基因，目的基因的表達根據(jù)經(jīng)qPCR 儀器檢測的Ct值，通過公式Folds=2-ΔΔCt進行相對定量分析，計算mRNA 表達水平。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用±s表示，組間比較采用方差分析（One-Way ANOVA），方差齊時選用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 法檢測IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白表達 與正常組比較，模型加藥組IL-1β表達顯著升高，IL-6、TGF-β表達升高，與模型組比較，其余三組的IL-1β、IL-6表達明顯抑制，模型加藥組TGF-β表達顯著上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2及圖 1。

表1 引物序列

表2 各組IL-1β、IL-6、TGF-β蛋白表達水平比較

圖1 細胞培養(yǎng)上清液中各組IL-1β、IL-6、TGF-β表達水平

2.2 qPCR檢 測 IL-1β、IL-6、TGF-β、TLR4、TRIB3的mRNA表達水平 與模型組比較，模型加藥組IL-1βmRNA表達抑制，其余三組IL-6、TLR4的mRNA表達下降，而TGF-βmRNA表達升高，正常組和正常加藥組TGF-βmRNA降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3及圖2。

表3 各組IL-1β、IL-6、TGF-β、TLR4、TRIB3的mRNA表達水平比較

圖2 各組IL-1βmRNA、IL-6mRNA、TGF-βmRNA、TRIB3mRNA、TLR4mRNA相對表達量

3 討論

DLASO是糖尿病患者嚴重并發(fā)癥，病變部位主要為膝下動脈，易出現(xiàn)遠端肢體的缺血壞死、潰瘍難愈、截肢等風(fēng)險，隨著血管介入治療手段的發(fā)展，解決臨床問題的同時帶來新的挑戰(zhàn)，動脈硬化閉塞血管支架置入術(shù)或經(jīng)皮腔內(nèi)血管擴張成形術(shù)（PTA）后易出現(xiàn)血管再狹窄，血管再狹窄發(fā)生機制與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，腔內(nèi)術(shù)后易出現(xiàn)血管結(jié)構(gòu)損傷和內(nèi)皮細胞功能紊亂，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，炎癥因子釋放促進內(nèi)膜過度增殖和細胞外基質(zhì)沉積，促進血管再狹窄的病理進展[2]。臨床研究報道冠脈支架術(shù)后再狹窄（ISR）發(fā)生患者IL-6 水平均較未發(fā)生 ISR 者明顯升高，抑制炎癥因子的表達可降低ISR的發(fā)生，中醫(yī)藥在防治ISR發(fā)生方面具有良好的臨床療效[7]。鞠上等[8]報道中藥益氣活血、化痰解毒，能防治糖尿病下肢血管病變PTA術(shù)后再狹窄。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯能夠抑制炎癥因子的釋放，本研究采用桃核承氣湯含藥血清為藥物干預(yù)。桃核承氣湯出自《傷寒論》，由桃仁、大黃、桂枝、炙甘草、芒硝組成，具有逐瘀瀉熱功效。桃仁能活血破瘀，大黃瀉下清熱，芒硝瀉熱軟堅，桂枝溫通血脈，防治大黃、芒硝寒涼之性，防治血液凝集，甘草調(diào)和藥性，緩和諸藥峻烈之性?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯具有活血祛瘀功效，能暢通血管，祛瘀消滯的作用，對動脈粥樣硬化模型鼠的炎癥因子有明顯的抑制作用[9]。動物兔實驗研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯對動脈硬化閉塞球囊擴張后再狹窄有防治作用[10]。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯防治2型糖尿病的作用是多靶點、多通路的，具有改善胰島素抵、降糖、調(diào)整脂質(zhì)代謝、抗炎等作用[11]。

LPS是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分，能誘導(dǎo)主動脈內(nèi)皮細胞損傷，LPS誘導(dǎo)制備主動脈內(nèi)皮細胞損傷模型[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組炎癥因子IL-1β、IL-6表達升高，抑炎因子TGF-β表達降低。加入桃核承氣湯含藥血清后，炎癥因子IL-1β、IL-6明顯抑制，TGF-β表達顯著升高，TLR4mRNA相對表達量降低?？梢?，桃核承氣湯含藥血清能抑制主動脈內(nèi)皮細胞炎癥因子IL-1β、IL-6的釋放，同時促進抑炎因子TGF-β表達，桃核承氣湯含藥血清抑制炎癥可能通過作用于TLR信號通路，減少TLR4mRNA的表達，進而下調(diào)IL-1β、IL-6炎癥因子有關(guān)。從而發(fā)揮LPS誘導(dǎo)主動脈內(nèi)皮細胞損傷的保護作用。劉云濤等[13]也發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯通過減少TLR4mRNA和CD4mRNA表達，下調(diào)IL-6等炎癥因子，具備減輕膿毒血癥大鼠小腸組織炎癥損傷。Toll樣受體4（TLR4）為I型跨膜蛋白，在信號介導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用，分布廣泛，在微血管內(nèi)皮細胞、心肌細胞、巨噬細胞、平滑肌細胞等均有分布，LPS可作為其配體，相結(jié)合可發(fā)生系列生物學(xué)效應(yīng)。大量文獻研究發(fā)現(xiàn)[14-16]，TLR4信號通路激活后可合成白細胞介素家族中的炎癥因子，參與動脈粥樣硬化過程，能加速平滑肌細胞增生，刺激斑塊形成，參與血管炎癥和血管重構(gòu)過程中。本研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯含藥血清抑制TLR4mRNA表達，下調(diào)IL-1β、IL-6炎癥因子，上調(diào)TGF-β因子，抑制血管內(nèi)皮細胞炎癥表達，可能在糖尿病下肢動脈硬化閉塞癥中發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)，減少ISR發(fā)生。