王 敏，李 疆，李 鵬，田 嘉，羅淑萍

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，烏魯木齊 830052；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，遼寧興城 125100)

0 引 言

【研究意義】扁桃(AmygdaluscommunisL.)屬于薔薇科李亞科桃屬扁桃亞屬，又被稱巴旦杏，是世界四大干果之一，我國(guó)扁桃的栽培分布區(qū)主要位于新疆喀什地區(qū)的英吉沙縣和莎車縣及和田地區(qū)[1]。扁桃為多年生果樹，一旦花期受到低溫凍害時(shí)，會(huì)嚴(yán)重導(dǎo)致花蕾受凍，坐果率降低，經(jīng)濟(jì)受到重大損失[2]。尤其是新疆周期性的凍害天氣，對(duì)扁桃的栽培產(chǎn)生了極大的影響。長(zhǎng)期以來(lái)，一般都是通過優(yōu)化栽培環(huán)境措施、改善栽培條件來(lái)提升扁桃的抗寒性，但是品種抗寒的遺傳特性才是起決定作用的因素。通過扁桃對(duì)自身凍害的抗性機(jī)制研究，有目的性的發(fā)掘利用與其抗性相關(guān)的基因，對(duì)提高栽培扁桃的抗逆能力，促進(jìn)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】脫水素(Dehydrin)在植物中是一類胚胎發(fā)育后期豐富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白)，屬于LEA D-Ⅱ家族,分子量大小從9到200 kD不等[3]，脫水素蛋白顯著的特征是在C端或其附近含有至少一個(gè)富含賴氨酸的基序，約15個(gè)氨基酸殘基(EKKGIMDKIKEKLPG)組成的K片段，K片段可以形成雙親性α-螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而α-螺旋則具有親水性和疏水性的雙重特征，是脫水素的重要功能結(jié)構(gòu)，此片段在不同物種間極為保守。N端含有保守基序T/VDEYGNP組成的Y片段，與植物和細(xì)菌分子伴侶的核酸結(jié)合位點(diǎn)具有同源性。K片段與Y片段之間有可以被磷酸化的約6個(gè)絲氨酸串聯(lián)構(gòu)成的S片段。所有的脫水素不一定都含有Y和S片段，但必定都含有K片段，它是第2組LEA區(qū)分于其它組的顯著特征[4-5]。脫水素的功能主要表現(xiàn)在植物受到環(huán)境脅迫導(dǎo)致細(xì)胞失水時(shí)能保持細(xì)胞內(nèi)膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，吸附多余的細(xì)胞內(nèi)部游離離子，降低游離離子對(duì)植物細(xì)胞的傷害；在植物水分缺失時(shí)，與其他功能性蛋白相結(jié)合，在逆境條件下保障其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能不異常，保證了植物逆境條件下正常的生理代謝功能維持[6-7]。低溫環(huán)境會(huì)致使膜脂的形態(tài)發(fā)生變化，膜透性增大后細(xì)胞內(nèi)的可溶性物質(zhì)滲漏，引起細(xì)胞死亡，是非常重要的非生物逆境之一。近幾年，研究證明在低溫脅迫下，植物脫水素基因的表達(dá)對(duì)植物抗寒性起正向作用。過量表達(dá)脫水素基因能增加擬南芥[8]的低溫抗性，提高抗寒力；小麥[9-10]脫水素WCS120的積累量與冰凍抗性成正相關(guān)，可以區(qū)分不同冬小麥品種的冰凍抗性強(qiáng)弱；兩種杜鵑[11]雜交后代的葉片中脫水素基因的表達(dá)與抗凍性能密切相關(guān)；香玲核桃[12]在低溫誘導(dǎo)下，DHN快速大量表達(dá)且參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中早期基因調(diào)控；茄屬[13]在低溫處理下脫水素蛋白合成量增加；馬鈴薯[14]DHN24基因轉(zhuǎn)黃瓜后可以顯著提高抗低溫脅迫能力；菠菜[15]中脫水素CAP85有明顯的抗凍能力?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】但關(guān)于扁桃DHN基因與抗性相關(guān)內(nèi)容尚未見報(bào)道。在經(jīng)濟(jì)林業(yè)研究中，克隆和分析某一功能基因可從分子水平上了解其結(jié)構(gòu)，可為直接利用該功能基因打下基礎(chǔ)[16-18]?！緮M解決的關(guān)鍵問題】試驗(yàn)克隆扁桃AcDHN1基因并對(duì)其生物信息學(xué)進(jìn)行分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體后在大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，為進(jìn)一步研究扁桃AcDHN1基因的分子生物學(xué)機(jī)理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

將一年生栽培扁桃'紙皮'的休眠枝進(jìn)行水培，等其長(zhǎng)出3 cm長(zhǎng)嫩葉后，置于4℃溫度下脅迫處理24 h，將嫩葉收集在液氮中處理。

大腸桿菌DH5α、pET-32a(+)質(zhì)粒由實(shí)驗(yàn)室保存，E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室制備?？寺≥d體pMD19-TVector、Pyrobest DNA Polymerasec、TaqDNA聚合酶、T4DNA連接酶及BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司。Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自全式金生物公司。瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、RNA提取試劑盒RNA plant plus reagentA、DNA Marker D15000+2000購(gòu)自天根生化科技有限公司。DNA Marker D2000購(gòu)于生工生物公司。引物由生工生物工程(上海)公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆

扁桃基因組RNA的提取使用天根總RNA提取試劑盒RNA plant plus reagentA。cDNA第一條鏈合成使用Thermo試劑盒。

根據(jù)GenBank公布的全長(zhǎng)DHN序列設(shè)計(jì)特異性引物AcDHN-F: 5'- ATGGCGCATT TTGGTTCAACACC-3'； AcDHN-R: 5'- TTAAGCTCCAGTTGTTGGGTG-3'，以扁桃cDNA為模板，PCR擴(kuò)增扁桃的AcDHN1基因。反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μL，模板cDNA 1 μL，dNTP MIX10 mmol/L、引物AcDHN-F/R(10 μmol/L)各0.5 μL，TaqDNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2 μL，加ddH2O補(bǔ)足到25 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min預(yù)變性；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 60 s反應(yīng)35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段，并將其連接到pMD 19-T載體上并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將篩選后的陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)

將獲得的扁桃AcDHN1基因在NCBI上用BLAST比對(duì)；使用ORF Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)尋找最長(zhǎng)的開放閱讀框；利用BioEdit軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行同源性分析比對(duì)；利用Protparam(http://web.expasy.org/protparam/)分析編碼蛋白的氨基酸序列的組成、相對(duì)分子質(zhì)量大小、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；使用BaCelLo在線軟件(http://gpcr2.biocomp.unibo.it/bacello/pred.htm)對(duì)扁桃AcDHN1氨基酸進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；使用Protscale軟件對(duì)AcDHN1的氨基酸序列的親水性/疏水性預(yù)測(cè)；利用MEGA5.0軟件對(duì)不同植物之間的DHN蛋白做系統(tǒng)發(fā)育分析。

1.2.3 原核表達(dá)載體pET-AcDHN1的構(gòu)建及原核表達(dá)

根據(jù)AcDHN1編碼框和原核表達(dá)載體pET-32a(+)多克隆酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物DHNyF: CGCGGATCCATGGCGCATTTTGGTTCAACACC;DHNyR:CCGCTCGAGTTAAGCTCCAGTTGTTGGGTG。在上下游引物的5'末端分別添加BamH I、Xho I酶切位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基。以克隆好的AcDHN1甘油菌提質(zhì)粒為模板，構(gòu)建重組載體，用BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶分別雙酶切重組質(zhì)粒DNA和pET-32a(+)原核表達(dá)載體。分別回收目的片段，T4DNA連接酶，連接后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，使用氨芐青霉素(Amp)抗性平板篩選重組質(zhì)粒，通過PCR及雙酶切檢測(cè)驗(yàn)證。重組表達(dá)載體命名為pET-AcDHN1。

1.2.4 融合蛋白在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET- AcDHN1轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，將培養(yǎng)好的重組質(zhì)粒菌液培養(yǎng)至OD600≈0.6，分別在不同誘導(dǎo)時(shí)間與不同IPTG濃度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。不同誘導(dǎo)時(shí)間：取1.0 mL菌液于離心管中，IPTG使用濃度為0.1 mmol/L，對(duì)照pET-32a(+)空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌誘導(dǎo)0和3 h，重組蛋白分別確定0、1、2、3、4、5、6 h誘導(dǎo)時(shí)間，溫度28℃。不同IPTG濃度：取1 mL菌液于離心管中，pET-32a(+)空表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌加入IPTG濃度為0、0.2 mmol/L作對(duì)照，重組蛋白分別確定0、0.02、0.05、0.1、0.15、0.2 mmol/L 6個(gè)不同IPTG濃度，溫度28℃，誘導(dǎo)時(shí)間3 h。收集菌體后分別加50 μL dd H2O和50 μL 2×SDS-PAGE上樣緩沖液用來(lái)裂解菌體，100℃條件下煮沸20 min，冷卻后取8 μL樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE(5%濃縮膠和12%分離膠)電泳分析，最終凝膠使用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并使用脫色液脫色至背景清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆與序列

擴(kuò)增后獲得了924 bp左右的片段。測(cè)序結(jié)果顯示該基因完整的開放閱讀框長(zhǎng)度為924 bp，起始密碼子ATG，終止密碼子為TAA，編碼308個(gè)氨基酸。圖1

M：DL2000 Marker；1～4：PCR產(chǎn)物 ；5：陰性對(duì)照M：DL2000 Marker；1-4：PCR product ；5：Negative control圖1 基因AcDHN1 PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR results of AcDHN1

2.2 生物信息學(xué)

2.2.1 氨基酸序列同源性

利用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，顯示AcDHN1氨基酸序列具有2類保守的特征區(qū)域，K和Y片段，屬于LEA蛋白的第二家族。對(duì)扁桃AcDHN1基因的氨基酸序列進(jìn)行Blastp比對(duì)及ClustalW多重比對(duì)，并將扁桃AcDHN1氨基酸序列與其他物種的DHN氨基酸進(jìn)行多序列對(duì)比分析。扁桃AcDHN1氨基酸序列與其他作物DHN氨基酸序列C末端都含有K片段，但K片段含量在不同作物之間不完全一致，而且有些作物在N末端的沒有Y片段。圖2，圖3

2.2.2 扁桃AcDHN1蛋白其他生物信息學(xué)功能

通過protparam tool軟件預(yù)測(cè)扁桃AcDHN1基因編碼蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為32.377 kD，理論等電點(diǎn)為5.92，分子式為C1387H2109N413O482S3，半衰期為30 h。該蛋白為穩(wěn)定的親水性蛋白。通過BaCelLo在線進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，扁桃AcDHN1氨基酸定位在細(xì)胞核中。

?部分為Y片段，橫線部分為K片段?This is Y segment；The horizontal line is K segment圖2 扁桃AcDHN1基因編碼序列和推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 CDS and deduced amino acid sequence of AcDHN1

扁桃(Amygdalus communis)AcDHN1(KT949395)；豌豆(Pisum sativum)：PsDHN1(P28639.1)；豌豆(Pisum sativum)；PsDHN2(P28640.1)；白梨(Pyrus bretschneideri)：Pb DHN(XM_009347773.1) ；碧桃(Prunus persica)：PpDHN(XM_007204276.1)；胡蘿卜(Daucus carota)：DaDHN(AB105039.1)； 白梨(Pyrus bretschneideri)：PbCS120(XM_009347771.1) 梅(Prunus mume)：PmDHN3(XM_008243512.1)；枇杷(Eriobotrya japonica)：EjDHN4(KF277188.1)；蘋果(Malus x domestica)：MdDHN4(JQ649459.1)；薺菜(Capsella rubella)：CrDHN(XM006281109.1)；越橘(Vaccinium corymbosum)：VcDHN(KF192819.1)Amygdalus communis：AcDHN1(KT949395)；Pisum sativum：PsDHN1(P28639.1)；Pisum sativum；PsDHN2(P28640.1)；Pyrus bretschneideri：Pb DHN(XM_009347773.1) ；Prunus persica：PpDHN(XM_007204276.1)；Daucus carota：DaDHN(AB105039.1)； Pyrus bretschneideri：PbCS120(XM_009347771.1)； Prunus mume：PmDHN3(XM_008243512.1)；Eriobotrya japonica：EjDHN4(KF277188.1)；Malus x domestica：MdDHN4(JQ649459.1)；Capsella rubella：CrDHN(XM006281109.1)；Vaccinium corymbosum：VcDHN(KF192819.1)圖3 不同植物DHN氨基酸序列同源比對(duì)Fig.3 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of DHN from different plants

2.2.3 扁桃AcDHN1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育

研究表明，其與巴旦杏DHN氨基酸序列同源性為86.72%，碧桃60.18%，蘋果55%，白梨32.79%，枇杷22%，梅26%，證明不同脫水素基因的序列之間存在較大差異，可能是不同物種的脫水素存在結(jié)構(gòu)上的差異性(YSK種片段的不同組合)。圖4

圖4 不同植物DHN氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree analysis of the deduced amino sequences of plants DHN protein

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及重組子的鑒定

使用DHNy-F/R引物對(duì)重組質(zhì)粒pET-AcDHN1進(jìn)行PCR檢測(cè)，可擴(kuò)增得到920左右的目的片段，使用BamHI和XhoI雙酶切重組質(zhì)粒pET-AcDHN1，可切出920 bp左右片段，pET-AcDHN1重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。圖5

M：DL15000 Marker；1～4 pET-AcDHN1雙酶切產(chǎn)物；5～7：PCR產(chǎn)物M：DL15000 Marker；1-4 pET- -AcDHN1 double enzyme product；5-7：PCR product圖5 重組質(zhì)粒pET-AcDHN1的PCR及雙酶切驗(yàn)證Fig.5 Restriction enzyme digestion and PCR analysis of pET-AcDHN1 recombinant plasmid

2.4 SDS-PAGE電泳

研究表明，重組質(zhì)粒pET-AcDHN1轉(zhuǎn)入Rosetta(DE3)在IPTG誘導(dǎo)下，預(yù)期的53 KD蛋白分子量附近有一條顯著的蛋白條帶，在一樣的誘導(dǎo)條件下空載體對(duì)照并未出現(xiàn)此條蛋白帶。在大腸桿菌中重組質(zhì)粒pET-AcDHN1誘導(dǎo)并成功表達(dá)出了AcDHN1蛋白。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，不同濃度IPTG的誘導(dǎo)時(shí)，隨著濃度的增高蛋白量的表達(dá)逐步的增加，濃度到0.1 mmol/L后總蛋白表達(dá)量增幅不顯著(圖6A)；7個(gè)不同時(shí)間的誘導(dǎo)條件下，蛋白量的表達(dá)先穩(wěn)步增加后基本不變，推測(cè)誘導(dǎo)時(shí)間為3 h達(dá)到最高表達(dá)量(圖6B)。不同誘導(dǎo)時(shí)間及不同濃度的誘導(dǎo)劑對(duì)重組蛋白的表達(dá)都會(huì)有一定的影響。通過對(duì)誘導(dǎo)條件優(yōu)化，重組蛋白pET-AcDHN在誘導(dǎo)時(shí)間為3 h及IPTG濃度為0.1 mmol/L，出現(xiàn)最佳表達(dá)量。圖6

M：蛋白Marker；泳道1，2為pET-32a(+)空載體IPTG 終濃度為0，0.2 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)3 h；泳道3～8為pET-AcDHN1 IPTG 終濃度分別為0，0.02，0.05，0.1，0.15，0.2 mmol/L時(shí)誘導(dǎo)3 h

M reprsents protein molecular weight marker, line 1 and 2 were pET-32a(+) induced with 0.1 mmol/L IPTG for 3 h; line 3-8 were pET-AcDHN1 induced with 0 mmol/L, 0.02 mmol/L, 0.05 mmol/L, 0.1 mmol/L, 0.15 mmol/L, 0.2 mmol/L IPTG for 3 h

M：蛋白Marker；IPTG 終濃度為0.1 mmol/L時(shí)，泳道1，2分別為pET-32a(+)空載體誘導(dǎo)0 h，3 h；泳道3～9分別為pET-AcDHN1誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5，6 h；M reprsents protein molecular weight marker, line 1 and 2 were pET-32a(+) induced with 0.1 mmol/L IPTG for 0 h and 3 h, line 3-9 were pET-AcDHN1 induced with 0.1 mmol/L IPTG for 0 h, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, and 6 h圖6 融合蛋白pET- AcDHN1在大腸桿菌中的SDS-PAGE誘導(dǎo)表達(dá)Fig.6 SDS-PAGE analysis of the expression of recombined pET- AcDHN 1 in E.coli

3 討 論

脫水素基因是典型的逆境誘導(dǎo)型基因，在植物遭受逆境脅迫時(shí)產(chǎn)生廣泛的生物學(xué)功能[5]。根據(jù)Close 等[5]的分類依據(jù)，脫水素初步分為5類，即YnSK2、Kn、KnS、SYn和Y2Kn，其中Y2Kn型則是含有二個(gè)Y片段及一到二個(gè)K片段，是一類典型的酸性的脫水素基因；Y2Kn及KnS兩個(gè)類型優(yōu)先易受低溫誘導(dǎo)。例如豇豆[19]Y2Kn型的DHNI，它與種子形成過程中的抗凍相關(guān)；桃樹[20]PpDHN1編碼一個(gè)Y2K2型脫水素蛋白，在低溫誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)量增加；低溫鍛煉后，大麥[21]Dhn5 (Kn型) 大麥DHN8 (SKn型)的積累量與其抵御凍害能力成正相關(guān)。試驗(yàn)從扁桃中克隆得到脫水素基因AcDHN1，屬于典型的Y2Kn型脫水素，受低溫誘導(dǎo)調(diào)控。

脫水素是與一類與植物抗逆有關(guān)的功能蛋白，若想清楚此蛋白在冷調(diào)節(jié)途徑中是如何發(fā)揮功能左右，則需要從蛋白水平上進(jìn)行進(jìn)一步的探究，而原核表達(dá)體系是一項(xiàng)完善且成熟的研究蛋白質(zhì)功能和結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)操作[22]。研究利用新疆栽培扁桃中克隆獲得AcDHN1 基因成功構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-32a(+)中，并在大腸桿菌(ED3)中表達(dá)了得到的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為53 KD。前期通過軟件預(yù)測(cè)AcDHN1蛋白分子量為32.38 kD，而在原核表達(dá)載體pET-32a(+)中TrxoTag、HisoTag和SoTag等融合標(biāo)簽蛋白為20.40 KD[23,24]，所以52.78 KD的融合蛋白大小與53KD電泳結(jié)果無(wú)明顯出入。通過對(duì)重組蛋白的誘導(dǎo)條件優(yōu)化，最終得到在誘導(dǎo)時(shí)間為3 h和0.1 mmol/L的IPTG濃度條件下AcDHN1重組蛋白其表達(dá)量最適。

SDS-PAGE檢測(cè)得到，pET-32a(+)空載體表達(dá)量非常小，誘導(dǎo)時(shí)間增加時(shí)重組蛋白的表達(dá)量不斷增高，至3 h之后表達(dá)量增高不顯著。說(shuō)明工程菌的表達(dá)效率并不是隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加表達(dá)量逐步升高，確是在3 h表達(dá)活性達(dá)到最強(qiáng)。推測(cè)原因伴隨時(shí)間的持續(xù)，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸減少，不能提供細(xì)菌的持續(xù)需求[25,26]。為了使重組蛋白高效表達(dá)，最終確定最佳的誘導(dǎo)時(shí)間3 h，選用最優(yōu)的0.1 mmol/L IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG濃度低條件下對(duì)誘導(dǎo)效果影響不大，但超高的IPTG濃度條件下致使工程菌受到毒害作用進(jìn)而生長(zhǎng)受到抑制。

4 結(jié) 論

研究克隆得到了一個(gè)脫水素基因，命名為AcDHN1，該基因全長(zhǎng)924 bp、編碼308個(gè)氨基酸的多肽，為穩(wěn)定的親水性蛋白，屬于Y2Kn型酸性脫水素。通過生物信息學(xué)分析推測(cè)蛋白分子質(zhì)量為32.4kD，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。同源分析結(jié)果顯示，其與巴旦杏親緣關(guān)系近DHN氨基酸序列同源性達(dá)到86.72%。構(gòu)建了pET-AcDHN1重組質(zhì)粒，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，在大腸桿菌中成功表達(dá)了與預(yù)期長(zhǎng)度一致大小約為52.7 kD蛋白分子量的融合蛋白。對(duì)重組蛋白的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化后，確定該基因在IPTG濃度0.1 mmol/L、誘導(dǎo)3 h表達(dá)量最佳。