鄧永平 段 睿 王曉杰 艾瑞波 劉曉蘭

(1.齊齊哈爾大學食品學院，黑龍江齊齊哈爾161006；2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室，黑龍江齊齊哈爾161006）

類胡蘿卜素是由所有光合生物和一些非光合作用的古生菌、真細菌、真菌合成的具有多烯骨架的異戊二烯類化合物[1]。在動物飼料中添加一定量的類胡蘿卜素，有利于改善動物體色和羽毛顏色，增加觀賞性[2]；也有利于提高動物的生產(chǎn)性能、機體免疫力、繁殖效率等[3-4]，對增加養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟效益具有一定的推動作用。

通過生物（植物、微生物）提取法和化學合成法均可獲取類胡蘿卜素[1]?；瘜W合成色素的安全性備受質(zhì)疑，一些化學合成類胡蘿卜素（如蝦青素）已被發(fā)現(xiàn)有害并且禁止藥店銷售[5-6]。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和人們對食品安全的認識不斷提高，生物提取法獲得的天然來源的類胡蘿卜素需求量越來越大。植物來源的天然類胡蘿卜素生產(chǎn)成本相對較高，且受季節(jié)影響；而微生物來源的天然類胡蘿卜素由于具有天然、高效、生產(chǎn)成本低、易實現(xiàn)工業(yè)化的優(yōu)點而受到科研工作者的青睞。

本文對微生物來源的天然類胡蘿卜素的開發(fā)現(xiàn)狀進行了綜述，以期為產(chǎn)率高、經(jīng)濟可行的微生物法制備類胡蘿卜素提供新的思路。

1 微生物源類胡蘿卜素的合成代謝途徑

在產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物代謝中，異戊二烯焦磷酸（IPP）及其異構(gòu)體二甲烯丙烯焦磷酸（DMAPP）是合成所有已知類胡蘿卜素的共同前體物[7]。在古生菌、一些革蘭氏陽性菌以及真菌中，IPP 是以乙酰CoA 為原料，經(jīng)MVA 途徑合成；而在大多數(shù)真菌和細菌（如E. coli）、藻類中IPP 和DMAPP 是以丙酮酸與3-磷酸甘油醛為原料，經(jīng)MEP 途徑合成；某些鏈霉菌屬（Streptomycetes）同時具有上述兩種途徑[8]。

由MVA 和MEP 途徑合成的IPP 及其異構(gòu)化產(chǎn)物DMAPP 在異戊二烯轉(zhuǎn)移酶的催化下以頭尾連接的方式使碳鏈延長，合成牻牛兒基焦磷酸（GPP、C10）、法尼焦磷酸（FPP、C15）或牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP、C20）[9]。在八氫番茄紅素合成酶（CrtB）催化下兩分子的GGPP 尾尾連接，形成無色的八氫番茄紅素（phytoene）。八氫番茄紅素脫氫酶基因（CrtI）是將無色的類胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成紅色的類胡蘿卜素的關(guān)鍵基因。在CrtI 的催化下八氫番茄紅素多步脫氫，形成多種類胡蘿卜素合成代謝的重要前體物——紅色的番茄紅素（lycopene）。番茄紅素在番茄紅素環(huán)化酶（CrtY）催化形成β-胡蘿卜素（β-carotene）或含γ-環(huán)、ε-環(huán)的類胡蘿卜素。隨后，β-胡蘿卜素經(jīng)β-胡蘿卜素羥化酶（CrtZ）和β-胡蘿卜素酮酶（CrtW）的作用轉(zhuǎn)化為玉米黃質(zhì)（zeaxanthin）、角黃素（canthaxanthin）和蝦青素（astaxanthin）。來源于不同菌株的β-胡蘿卜素酮酶基因（crtW）會因其不同的反應特性催化β-胡蘿卜素形成多種中間體，從而形成不同的類胡蘿卜素[10-11]。

2 微生物產(chǎn)類胡蘿卜素的研究現(xiàn)狀

能夠合成類胡蘿卜素的微生物包括藻類、真菌、真細菌、古生菌等其中的某些屬或種。類胡蘿卜素作為生物體一種重要的抗氧化劑，其含量受多種氧化應激條件及前體物等的誘導，適當?shù)牟捎么碳ひ蛩丶罢T導劑對培養(yǎng)過程進行處理有助于提高類胡蘿卜素的產(chǎn)量。

2.1 微藻類胡蘿卜素

微藻具有與高等植物相似的光合作用產(chǎn)能方式，是很有商業(yè)前景的類胡蘿卜素產(chǎn)生菌[12]。微藻類胡蘿卜素為9-順式與全反式β-胡蘿卜素異構(gòu)體組成，相比于化學合成類胡蘿卜素（全反式）具有更好的脂溶性和結(jié)晶性[13]。關(guān)于微藻產(chǎn)類胡蘿卜素的研究已有較多報道，其中鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）、雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）等是產(chǎn)類胡蘿卜素的主要藻類。

鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）是天然β-胡蘿卜素的最佳來源之一，在有強烈光照、高濃度鹽、高溫和營養(yǎng)缺乏的條件下，產(chǎn)量最多可占細胞干重的13%[14]，經(jīng)超臨界二氧化碳（SC-CO2）提取后產(chǎn)量可達115.43 μg/g 干微藻[15]。鹽生杜氏藻產(chǎn)類胡蘿卜素受光照和氮源的影響極大，培養(yǎng)后期氮源耗竭后，由于微藻細胞分裂速率的瞬時增加，細胞密度線性增加，光照下的生物量產(chǎn)量大約增加了一倍，同時，β-胡蘿卜素開始在細胞內(nèi)積累[16]。Prieto 等[17]利用開放式罐-封閉的管狀光生物反應器兩階段培養(yǎng)鹽生杜氏藻，在第二階段控制氮源的條件下獲得了最高的類胡蘿卜素產(chǎn)量（328.8 mg/月），其中9-順式與全反式β-胡蘿卜素異構(gòu)體比率（1.5）達到最高。Sui 等[18]采用缺氮和高光照兩步培養(yǎng)法實現(xiàn)了鹽生杜氏藻蛋白質(zhì)和類胡蘿卜素的聯(lián)合生產(chǎn)，產(chǎn)量分別為22.7 mg/(l·d)和3 mg/(l·d)。

雨生紅球藻是天然蝦青素的最主要的來源。蝦青素的生產(chǎn)過程包括細胞生長期（綠色）和胞內(nèi)蝦青素積累期（紅色）兩階段。在細胞生長至穩(wěn)定期后，營養(yǎng)物質(zhì)逐漸匱乏，雨生紅球藻細胞生長減緩，胞內(nèi)開始積累蝦青素[19-20]，這個過程受碳源誘導物、光呼吸作用以及初始生物量密度（IBD）等因素影響。在培養(yǎng)基中加入一定量的有機碳源可顯著提高蝦青素的產(chǎn)量。Cordero 等[21]在雨生紅球藻培養(yǎng)基中添加0.30 mM 和0.60 mM 乙酸鈉可分別使蝦青素產(chǎn)量提高1.83%和1.78%。Pan-utaia 等[22]在培養(yǎng)基中添加100 mM 乙酸鉀可進一步提高蝦青素的產(chǎn)量至286 g/l，較對照提高了285%。IBD 是影響雨生紅球藻細胞活力和生產(chǎn)力的一個重要因素，IBD 低易引發(fā)嚴重光抑制光合作用，IBD 高引起個體細胞的嚴重光限制易造成蝦青素產(chǎn)量降低，在0.8 g/l 初始生物量密度下培養(yǎng)H. pluvialis FlotowK-0084 的蝦青素產(chǎn)率最高為17.1 mg/(l·d)[23]。此外，光呼吸直接促進蝦青素代謝途徑關(guān)鍵中間產(chǎn)物三磷酸甘油酸水平，可以加速雨生紅球藻中的蝦青素積累[24]。

除了鹽生杜氏藻和雨生紅球藻外，研究人員在其他藻類中也發(fā)現(xiàn)了類胡蘿卜素。Sivathanu 等[25]利用HPLC-NMR 和LC-MS-APCI 對土生綠球藻產(chǎn)類胡蘿卜素進行了表征，發(fā)現(xiàn)其包含紫黃質(zhì)、蝦青素、葉黃素、玉米黃質(zhì)、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素6 種組分。經(jīng)二氯甲烷提取，在淡水藻中型鞘藻（Oedogonium intermedium）中提取到類胡蘿卜素，其含量達(3 411.2±20.7) μg/g，經(jīng)HPLC-PDA-APCI-ITTOF-MS 鑒定到包括新黃素、9'-順式-新黃質(zhì)、洛羅黃質(zhì)、紫黃質(zhì)、葉黃素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素共七種主要的類胡蘿卜素，具有顯著的抗氧化活性[26]。此外，在細小裸藻（Euglena gracilis）類胡蘿卜素生物合成時，β-胡蘿卜素羥化酶基因EgCYP97H1 是類胡蘿卜素生物合成必需基因，編碼β-胡蘿卜素單羥化酶，在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)該藻類中生物合成光敏性類胡蘿卜素[27]。

高光強度、高鹽度、極端溫度和氮缺乏等應激條件是增強藻類細胞中類胡蘿卜素積累的主要因素。當光強度高于微藻光合作用所需的光強度時，就會過量產(chǎn)生β-胡蘿卜素以克服光脅迫和潛在的光氧化損傷[28]。另外，通過基因水平進行調(diào)控，成為了提高微藻類胡蘿卜素產(chǎn)量的新手段。通過藍光可誘導蝦青素的生物合成途徑基因psy、pds、dgat1 和dgat2d 上調(diào)表達，從而使雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）積累了大量的蝦青素，分別比白光和紅光高4.0倍和6.7倍[29]。

2.2 真菌類胡蘿卜素

真菌類胡蘿卜素一般為C40 或C40 衍生物。產(chǎn)類胡蘿卜素真菌包括三孢布拉霉（Blakeslea trispora）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、法夫酵母（Xanthophyllomyces dendrorhous）等。

B. trispora隸屬于毛霉目，是目前少數(shù)已用于商業(yè)化生產(chǎn)類胡蘿卜素的菌種[30]。該菌在（-）和（+）菌株有性繁殖階段產(chǎn)生的接合孢子與類胡蘿卜素的合成密切相關(guān)，在接合孢子形成中八氫番茄紅素合成酶的含量快速提高，與此同時，類胡蘿卜素含量也快速增加[31]。B. trispora合成的類胡蘿卜素種類受碳源的影響，當以乳糖類為碳源時，優(yōu)先合成全反式-β-胡蘿卜素[31]；當以油脂為底物時，可增強β-胡蘿卜素產(chǎn)量，而番茄紅素的產(chǎn)量有所降低[32]；當有性繁殖培養(yǎng)基中添加乙酸鈉時，乙酸鈉通過檸檬酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為甲羥戊酸酯合成異戊二烯的底物乙酰-CoA，提高B. trispora中β-胡蘿卜素的生物合成參與基因hmgR、ipi、carG、carRA 和carB 基因轉(zhuǎn)錄水平，使β-胡蘿卜素的產(chǎn)量提高80%以上[33]。

B. trispora在外源干預下可積累番茄紅素。三丙胺通過抑制環(huán)化酶活性，并通過上調(diào)與萜類生物合成相關(guān)的基因的表達，來增強B.trispora的番茄紅素含量，經(jīng)1.8 g/l 三丙胺處理2 d 后，番茄紅素的比例從總類胡蘿卜素的1.7%增加到90.1%，產(chǎn)量達到83.2 mg/g 干物質(zhì)，是對照組的315.8 倍[34]；雙功能蛋白基因carRA 編碼八氫番茄紅素合酶和番茄紅素環(huán)化酶，為了提高番茄紅素的產(chǎn)量，Wang 等[35]對carR和carA基因敲除菌株以及carA過表達菌株進行了研究，發(fā)現(xiàn)carRA 基因收到破壞會使菌株喪失合成類胡蘿卜素的能力，而carA 過表達菌株使番茄紅素含量增加了2.26倍。

粗糙脈孢菌孢子呈橘紅色或黃色，內(nèi)含番茄紅素、紅酵母烯、鏈孢霉黃素、β-胡蘿卜素等多種類胡蘿卜素[36]。O2和H2O2刺激可觸發(fā)光誘導的粗糙脈孢菌類胡蘿卜素的合成[37]。此外，在低溫下經(jīng)光誘導可提高結(jié)構(gòu)基因的mRNA水平，也有利于類胡蘿卜素產(chǎn)量的提高[38]。

X. dendrorhous是商業(yè)生產(chǎn)蝦青素的優(yōu)勢菌，但蝦青素的產(chǎn)量相對較低[39]。Marcoleta Andres 等研究了乙醇與蝦青素合成的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)乙醇的合成受抑制時有利于蝦青素的積累，這一結(jié)果在Xiao的研究中也被證實，此外，X. dendrorhous菌體代謝產(chǎn)物如菌體蛋白、脂肪酸受抑制時也有利于蝦青素的積累[40-41]。谷氨酸通過促進葡萄糖代謝，降低了TCA循環(huán)對乙酰輔酶A 的利用，而表現(xiàn)出對X. dendrorhous蝦青素積累的積極影響，最大含量高達1.14 mg/g（DCW），比對照組高40.7%[42]。

Sakaki等[43]報道光輻射產(chǎn)生的氧化作用誘導了類胡蘿卜素的積累，在光輻射條件，紅酵母紅素的產(chǎn)量比黑暗條件下增加180%。在解脂耶氏酵母培養(yǎng)基中添加煙草可增加總類胡蘿卜素的產(chǎn)量[44]。Mahmoud Yolmeh 等[45]利用紫外線和疊氮化鈉誘變粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）PTCC 5256，獲得一株高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量可達8.36 g/l。

2.3 細菌類胡蘿卜素

細菌合成了迄今發(fā)現(xiàn)的所有C45 和大多數(shù)C30 和C50 類胡蘿卜素，而其余的則由古細菌產(chǎn)生，類胡蘿卜素數(shù)據(jù)庫中包括來自170 種細菌的307 種類胡蘿卜素和來自9 種古細菌的19 種類胡蘿卜素[46]。

在紅螺菌（Rhodospirillum rubrum）幼齡細胞中發(fā)現(xiàn)了番茄紅素、螺旋黃素等類胡蘿卜素[47]。通過代謝工程手段將球形紅細菌（Rhodobacter sphaeroides）的crtI4 基因?qū)隦hodospirillum rubrum中，敲除zwf 基因阻斷了競爭性磷酸戊糖途徑使番茄紅素產(chǎn)量提高了88%[48]。陳亞淑等[49]對北極海洋紅球菌（Rhodococcus sp.）B7740 產(chǎn)類胡蘿卜素進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)極端環(huán)境改變了類胡蘿卜素的存在形式，在該菌株的代謝產(chǎn)物中存在2 種類胡蘿卜素的衍生物——甲基萘醌類類胡蘿卜素，通過液相色譜-質(zhì)譜鑒定出2 種萘醌類類胡蘿卜素，相對分子質(zhì)量分別 為720.6 和718.6，化 學 分 子 式 是C51H76O2和C51H74O2。Tian 等[50]從極端環(huán)境中分離到了抗輻射球菌R13（Deinococcus xibeiensis R13），該菌在C/N 比為1∶5 和10 μMFe2+存在下可產(chǎn)抵抗γ射線和紫外線照射的類胡蘿卜素，產(chǎn)量為6.64 mg/l，比原條件增加了84%。盛冉等[51]在魯氏不動桿菌Acinetobacter lwoffiiUL 發(fā)酵產(chǎn)物中提取到蝦紅素及較少的蝦青素。

極端嗜鹽古菌（Haloferax mediterranei）在含5%～28%NaCl（w/v）的條件下可產(chǎn)生具有強抗氧化特性的C50 類胡蘿卜素，經(jīng)HPLC-MS 檢測到四種類胡蘿卜素的異構(gòu)體[52]。

3 未來研究方向

相對于植物而言，微生物來源天然類胡蘿卜素的生產(chǎn)周期短，產(chǎn)率高，而且杜氏藻及三孢布拉氏霉類胡蘿卜已經(jīng)進入到工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)階段，但是還存在如下問題：①微藻類胡蘿卜素的生產(chǎn)成本較高，無法與傳統(tǒng)的化學合成方法和其他技術(shù)（例如從植物來源提?。└偁?；另一方面，利用微藻類大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素生產(chǎn)周期長，且需要嚴格的控制和維護培養(yǎng)過程；②三孢布拉氏霉來源的β-類胡蘿卜素生產(chǎn)周期長、菌體易衰退、關(guān)鍵基因的調(diào)控機理尚待進一步研究。

為了解決上述問題，可以從以下三方面展開研究：①降低類胡蘿卜素生產(chǎn)成本。類胡蘿卜素的生產(chǎn)原料往往占總成本的30%～70%，以工業(yè)、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物作為廉價的營養(yǎng)來源是降低類胡蘿卜素生產(chǎn)成本的一個主要途徑，同時還可以提高工農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的附加值。但是，為了使新生產(chǎn)工藝具有競爭力和可持續(xù)性，需要對新的原料的價格、來源進行評估。此外，針對類胡蘿卜素種類選擇特定碳源，適當優(yōu)化基于工業(yè)、農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的培養(yǎng)基的配方以確保高產(chǎn)類胡蘿卜素，從而降低生產(chǎn)成本。②通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段獲得高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株。合成生物學方法可用于改善關(guān)鍵酶的活性，以生產(chǎn)合成代謝途徑所需的代謝產(chǎn)物，通過合成生物學手段可以異源合成生產(chǎn)周期短、高產(chǎn)類胡蘿卜素菌株。③開發(fā)新的、高安全性的類胡蘿卜素高產(chǎn)菌株。