何翔 李翱 李楚

摘要 為明確滇重樓Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz一種新的葉斑病病原菌，以云南省麗江市玉龍納西族自治縣中藥材種植基地內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種新真菌性病害為供試研究材料，經(jīng)單孢分離培養(yǎng)、形態(tài)特征觀察、致病性測定、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析（ITS、tub2、tef1）和生物學(xué)特性測定，對病原物進(jìn)行分類鑒定。研究結(jié)果表明，病原物CL107形態(tài)符合Pestalotiopsis sp.種屬典型特征;菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）與參比標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).oryzae CBS 353.69同源性分別為100.00%、100.00%、98.92%，可將稻曲擬盤多毛孢P.oryzae確定為滇重樓葉斑病病原物。生物學(xué)特性研究表明，PDA培養(yǎng)基、pH 8.0、28℃、全黑暗條件有利于菌株CL107菌絲生長和分生孢子形成，以葡萄糖為碳源有利于純化菌株菌絲生長和產(chǎn)孢;以酵母提取物為氮源有利于純化菌株菌絲生長，以牛肉膏為氮源有利于純化菌株產(chǎn)孢。本研究首次報道稻曲擬盤多毛孢P.oryzae可侵染滇重樓植株，引起真菌性葉斑病，明確影響病害發(fā)生的環(huán)境因子，為該葉斑病的診斷與防治提供科學(xué)依據(jù)和理論指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 滇重樓; 葉斑病; 稻曲擬盤多毛孢; 生物學(xué)特性

中圖分類號： S 435.67

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019497

Abstract

In order to characterize a new fungal leaf spot disease of Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch） Hand.-Mazz， the fungal pathogens were isolated in a Chinese herbal medicine planting base in Yulong Naxi autonomous county， Lijiang， Yunnan. The pathogens were classified and identified based on single spore isolation culture， morphological observation， pathogenicity assay， multi-gene phylogenetic analysis （ITS， tub2， tef1） and biological characteristics. The results showed that the pathogen morphology of CL107 was consistent with the typical characteristics of Pestalotiopsis sp.; strains CL107-ITS （accession no. MK156295）， CL107-BT （accession no. MN015425）， CL107-EF1 （accession no. MN022941） and the reference standard strain P.oryzae CBS 353.69 shared a high homology of 100.00%， 100.00% and 98.92%， respectively. P.oryzae was the leaf spot disease pathogen of P.polyphylla var. yunnanensis. The biological characteristics of the strain CL107 was beneficial to mycelial growth and conidial formation in PDA medium at pH 8.0， 28℃， and under all dark conditions. The use of glucose as the C source was beneficial to the growth and sporulation of the purified strains. The yeast extract was used as the N source， which was beneficial to the mycelium growth of the purified strain， and the beef extract used as the N source could facilitate the sporulation of the purified strain. This study firstly reported that P.oryzae could infect P.polyphylla var. yunnanensis， which caused fungal leaf spot. The environmental factors affecting the occurrence of the disease were also identified， which would provide a scientific basis and theoretical support for the prevention and control of the leaf spot disease.

Key words Paris polyphylla var. yunnanensis; leaf spot disease; Pestalotiopsis oryzae; biological characteristics

滇重樓Paris polyphylla var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz，別名獨(dú)角蓮，多年生草本植物，具清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚等功效，是我國一種重要的傳統(tǒng)藥用植物，主要分布在云南、四川、貴州等地[1-2]。云南是我國藥用植物資源種類最豐富的地區(qū)，也是滇重樓主要的種植區(qū)。近年來，由于長期的掠奪性采挖和飆升的藥用需求量，使得野生滇重樓種質(zhì)資源急劇減少，目前依靠人工種植滿足市場需求[3]。隨著滇重樓種植產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，由于種植管理模式、自然氣候條件等方面的不足，滇重樓各類病害問題日益凸顯。據(jù)前人研究報道，云南省中藥材種植區(qū)滇重樓病害種類主要有根腐病[4-5]、軟腐病[6-7]、立枯病[8]、細(xì)菌性穿孔病[8]、白霉病[4，9]、褐斑病[9]、灰霉病[10]等; 由重樓柱隔孢Ramularia paris引起的白霉病和細(xì)鏈孢Alternaria tenuis 引起的褐斑病是目前已報道的兩種滇重樓葉部病害。滇重樓葉斑病主要為害葉片，植株發(fā)病時葉片正面形成圓形、橢圓形或不規(guī)則的病斑，嚴(yán)重時感病植株葉片正面病斑連片，變褐枯黃甚至植株死亡，直接影響滇重樓的產(chǎn)量和品質(zhì)，給種植戶帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失;同時葉斑病也成為大規(guī)模發(fā)展滇重樓種植業(yè)的潛在威脅，且此類病害的防治已成為生產(chǎn)中極為突出的問題。

近年來，關(guān)于Pestalotiopsis sp.種屬的分類已有大量的研究報道，主要集中在分生孢子的形態(tài)特征和寄主的專一性方面，研究者對種屬分類鑒定的依據(jù)大多相似，因而給此類微生物的鑒定工作帶來了較大的難題[11-12]。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，多基因系統(tǒng)發(fā)育分析已成為植物病原菌分類鑒定可信度較高的技術(shù)手段。Liu等[13]運(yùn)用ITS和β-tubulin對Pestalotiopsis sp.真菌進(jìn)行多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，并結(jié)合形態(tài)特征觀察，發(fā)現(xiàn)分生孢子內(nèi)著色的細(xì)胞顏色是相對穩(wěn)定的，可作為此類真菌分類的重要依據(jù)。李曼等[14]采用形態(tài)學(xué)鑒定和ITS、tef1多基因測序?qū)χ参飪?nèi)生Pestalotiopsis sp.真菌進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，認(rèn)為分生孢子頂端細(xì)胞的附屬絲是否呈匙狀膨大是對擬盤多毛孢暗色類群進(jìn)一步分類鑒定的重要特征。Maharachchikumbura等[15-16]選擇ACT、β-tubulin、CAL、GAPDH、GS、LSU、RPB1、SSU、ITS和tef1等10個基因?qū)estalotiopsis sp.真菌進(jìn)行分類定種，研究結(jié)果表明ITS、β-tubulin和tef1等3個基因的鑒定效果較好;此外，將ITS、β-tubulin和tef1 3個基因序列聯(lián)合分析能更準(zhǔn)確可靠地對Pestalotiopsis sp.真菌進(jìn)行種屬的區(qū)分。本研究采用此方法對供試病原菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定和多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，探明其詳細(xì)分類信息，為病害防控提供理論支撐。

目前，國內(nèi)外尚未有關(guān)于稻曲擬盤多毛孢P.oryzae在滇重樓上危害的研究報道。據(jù)此，本研究通過對滇重樓葉斑病病原分子生物學(xué)鑒定及生物學(xué)特性測定，明確滇重樓葉斑病病原物及其詳細(xì)分類信息，探索影響病害發(fā)生流行的環(huán)境因素，以期為該病害的田間診斷和有效防治提供科學(xué)依據(jù)和理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株與材料

本研究具典型葉斑病癥狀的滇重樓標(biāo)樣采自云南省麗江市玉龍納西族自治縣中藥材種植基地（100°23′28″E，26°51′43″N）。采用組織分離法分離病原菌，切取3 mm×3 mm大小病健交界處的葉片組織，用10%次氯酸鈉溶液浸泡20 s，然后用75%乙醇消毒30 s，最后用無菌水漂洗3次，轉(zhuǎn)至PDA平板培養(yǎng)基中央，25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)至菌落產(chǎn)孢，分離菌株單孢純化培養(yǎng)，并保存?zhèn)溆谩?/p>

供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養(yǎng)基、查氏（Czapek）培養(yǎng)基、水瓊脂（water agar， WA）培養(yǎng)基、燕麥瓊脂（OA）培養(yǎng)基、滇重樓汁液（PLA）培養(yǎng)基、滇重樓汁液+PDA（PLA+PDA）培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基、MKB培養(yǎng)基，9種培養(yǎng)基的制備參照陳全助等[17]，穆曉紅等[18]的方法進(jìn)行。

1.2 致病性測定

根據(jù)柯赫氏法則，選取滇重樓植株健康葉片，以直徑5 mm的菌餅作為接種體，采用無傷接種法，并放置于MGC-450HP人工氣候箱內(nèi)（25～30℃）保濕培養(yǎng)，定期觀察并記錄植株發(fā)病情況。以無菌水處理作空白對照，每處理4次重復(fù)。待植株發(fā)病后，分離發(fā)病植株葉片病斑上的病原物，于Nikon Eclipse E200熒光生物顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，并與接種菌株孢子形態(tài)比較。

1.3 病原鑒定

1.3.1 形態(tài)特征觀察

無菌條件下，取直徑7 mm純化好的單孢菌餅接種至PDA培養(yǎng)基上，25℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)至菌落形成，觀察菌落培養(yǎng)性狀;待菌株產(chǎn)孢后，在Nikon Eclipse E200熒光生物顯微鏡下觀察并測量產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子的形態(tài)及大小。

1.3.2 多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

采用CTAB法提取純化菌株總DNA[19]。采用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增菌株ITS序列[20]，采用T1（5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′）和BT2B（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）擴(kuò)增菌株β-tubulin （tub2）序列[21]，采用EF1-728F（5′-CATCGAGAAGTTCGAGAAGG-3′）和EF1-986R（5′-TACTTGAAGGAACCCTTACC-3′）擴(kuò)增菌株tef1序列[22]。PCR反應(yīng)采用熱啟動程序，所用到的10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶、dNTPs均購自大連寶生物科技有限公司。PCR 30 μL反應(yīng)體系：10 mmol/L 10×PCR Buffer 3.0 μL、2 mmol/L dNTPs 2.0 μL、5 U/μL Taq酶0.5 μL、10 mmol/L正向引物和反向引物各1.0 μL、DNA模板1.5 μL，ddH2O 21.0 μL。ITS反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min;95℃變性1 min，52℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃ 延伸10 min，4℃條件下保存。β-tubulin反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min;94℃變性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃ 延伸10 min，4℃條件下保存。tef1反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，63℃退火55 s，72℃延伸90 s，10個循環(huán);94℃變性30 s，53℃退火55 s，72℃延伸90 s，36個循環(huán)，72℃ 延伸7 min，4℃條件下保存。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，送至上海生工生物工程有限公司測序。測序結(jié)果經(jīng)BLAST 搜索（https：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）后與 GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬的基因序列進(jìn)行比較分析，選用同源性較高的模式菌株序列作為參比對象，用Clustal X 1.8軟件進(jìn)行多序列比對，計算供試菌株與參比菌株之間的序列相似性。系統(tǒng)發(fā)育分析時排除堿基缺失位點(diǎn)，采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0構(gòu)建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。其中，Bootstrap值設(shè)定為1 000，其余均為默認(rèn)值。

1.4 生物學(xué)特性測定

1.4.1 不同培養(yǎng)基對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

無菌條件下，取直徑7 mm純化好的單孢菌餅分別接種至上述9種供試平板培養(yǎng)基中央，并放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)15 d后每皿加入10 mL無菌水洗脫孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各處理的產(chǎn)孢量，每處理設(shè)置4個重復(fù)。

1.4.2 溫度對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，無菌條件下，取直徑7 mm純化好的單孢菌餅接種至PDA培養(yǎng)基中央，分別放置于5、10、15、20、25、28、30、32、35℃等9個溫度梯度恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)15 d后每皿加入10 mL無菌水洗脫孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各處理的產(chǎn)孢量，每處理設(shè)置4個重復(fù)。

1.4.3 光照對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，無菌條件下，取直徑7 mm純化好的單孢菌餅接種至PDA平板培養(yǎng)基中央，分別放置于25℃ 24 h全暗、12 h光照+12 h黑暗、24 h光照條件下恒溫培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)15 d后每皿加入10 mL無菌水洗脫孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各處理的產(chǎn)孢量，每處理設(shè)置4個重復(fù)。

1.4.4 pH對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用1 mol/L HCl 和1 mol/L NaOH溶液分別將培養(yǎng)基pH值調(diào)為40、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0等8個不同梯度。無菌條件下，取直徑7 mm純化好的單孢菌餅接種至不同pH的PDA平板培養(yǎng)基中央，并放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)15 d后每皿加入10 mL無菌水洗脫孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各處理的產(chǎn)孢量，每處理設(shè)置4個重復(fù)。

1.4.5 碳、氮源對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以相同含量的麥芽糖、乳糖、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇作為碳源，不添加碳源作無碳空白對照;分別以相同含量的蛋白胨、KNO3、酵母粉、牛肉膏、NaNO3、NH4Cl作為氮源，不添加氮源作無氮空白對照。無菌條件下，取直徑7 mm純化好的單孢菌餅接種至不同pH值PDA平板培養(yǎng)基中央，并放置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)5 d，培養(yǎng)結(jié)束后采用十字交叉法測量菌落直徑，培養(yǎng)15 d后每皿加入10 mL無菌水洗脫孢子，用血球計數(shù)板統(tǒng)計各處理的產(chǎn)孢量，每處理設(shè)置4個重復(fù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析處理

測定數(shù)據(jù)均采用Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)不同處理間的差異顯著性，數(shù)據(jù)結(jié)果利用DPS 7.05統(tǒng)計軟件計算分析，圖用Sigma Plot 12.5繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀與致病性測定

將種植基地采集到的滇重樓葉斑病標(biāo)樣進(jìn)行病原組織分離和單孢培養(yǎng)，獲得純化單孢菌株1株，記作CL107。經(jīng)致病性測定，純化單孢菌株CL107能侵染滇重樓并引起葉斑病。滇重樓健康葉片接種純化菌株并感病后，發(fā)病初期老葉葉片上有圓形或不規(guī)則的褐色病斑，病斑中心發(fā)白，邊緣呈暗褐色，有明顯輪紋;當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境較潮濕時，病斑正面由褐色變?yōu)楹诤稚?，并附著大量的黑色小點(diǎn)，即為葉斑病病原菌的分生孢子堆，背面附著灰色霉層。這與田間滇重樓植株發(fā)病癥狀相一致（圖1a、b），并且能從植株接種發(fā)病部位再分離到先前的接種菌，以無菌去離子水接種的空白對照植株不表現(xiàn)發(fā)病癥狀（圖1c）。根據(jù)柯赫氏法則，可將純化單孢菌株CL107確定為滇重樓葉斑病致病菌。

2.2 病原菌鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)特征觀察

單孢菌株CL107于PDA平板培養(yǎng)基25℃黑暗條件恒溫培養(yǎng)5 d后，菌落呈近圓形，正面白色，氣生菌絲濃密呈絮狀;背面淡黃色，具輪紋，菌落直徑4.98～5.25 cm（圖1d、e）。培養(yǎng)15 d后，菌落表面形成少量黑色黏液即為分生孢子堆，排列不規(guī)則，輪紋狀較5 d時更明顯，無氣味（圖1f）。菌株CL107成熟分生孢子呈直或略彎的紡錘狀，具3～4個隔膜，大?。?3.52～28.08）μm×（3.02～7.57）μm，孢子平均大小為23.25 μm×5.47 μm，中間3個細(xì)胞著色，上部2個細(xì)胞呈深褐色，細(xì)胞間隔處顏色較深，第3個細(xì)胞呈淺褐色，著色細(xì)胞長12.4～15.7 μm;分生孢子梗呈白色圓柱狀且較短，長2.7～5.5 μm;分生孢子頂端和尾端的細(xì)胞均呈圓錐狀，無色透明，頂端細(xì)胞有2～3根無色透明附屬絲，不分支，長11.3～24.8 μm（圖1g、h）。滇重樓接種發(fā)病狀態(tài)下，單孢菌株CL107分生孢子盤附著于葉片背面，呈黑色粒點(diǎn)狀，孢子形態(tài)大小與純化菌株培養(yǎng)結(jié)果一致（圖1i）。根據(jù)以上觀測特征結(jié)果，并參考前人研究結(jié)果[23-26]，將單孢菌株CL107初步確定為稻曲擬盤多毛孢P.oryzae。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

對分離病原單孢菌株CL107的ITS、tub2和tef1多基因進(jìn)行擴(kuò)增測序，獲得目的基因片段分別為588、779、266 bp，GenBank登錄號分別為MK156295、MN015425、MN022941。經(jīng)Blast 搜索并與 GenBank數(shù)據(jù)庫中相關(guān)種屬基因序列比較分析后，菌株CL107與Pestalotiopsis sp.具較高的同源性，挑選親緣性較高的同屬不同種菌株作為參比菌株，用Clustal X 1.8進(jìn)行多序列比對，并采用最大似然法（maximum likelihood analysis）用MEGA 7.0構(gòu)建供試菌株與參比菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株CL107-ITS（accession no. MK156295）、CL107-BT（accession no. MN015425）、CL107-EF1（accession no. MN022941）分別與參比標(biāo)準(zhǔn)菌株P(guān).oryzae CBS 353.69（accession no. NR147547）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199398）、P.oryzae CBS 353.69（accession no. KM199496）的相似性達(dá)100.00%、100.00%、98.92%，菌株間具較高同源性;結(jié)合形態(tài)特征鑒定結(jié)果，可將代表性單孢菌株CL107鑒定為稻曲擬盤多毛孢P.oryzae。

2.3 菌株生物學(xué)特性測定

2.3.1 不同培養(yǎng)基對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

不同培養(yǎng)基對菌株CL107菌絲生長和孢子形成具有一定的影響（表1）。供試培養(yǎng)基中，菌株CL107在PDA平板培養(yǎng)基上生長最快，在MKB平板培養(yǎng)基上生長最慢，與其余幾種供試培養(yǎng)基相比差異顯著（P<0.05）。此外，菌株CL107在不同培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀也有差異，PDA、PSA、OA、PLA和PLA+PDA培養(yǎng)基上菌株氣生菌絲較濃密，Czapek、YPD和MKB培養(yǎng)基上則較為稀薄，WA培養(yǎng)基上無氣生菌絲產(chǎn)生。菌株CL107在PDA平板培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高，顯著高于其余8種培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量（P<0.05），在WA培養(yǎng)基上不產(chǎn)孢，且菌株CL107在OA、PLA+PDA培養(yǎng)基上菌絲生長比PSA培養(yǎng)基上菌絲生長快但產(chǎn)孢量反而低。

2.3.2 溫度對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

不同培養(yǎng)溫度對菌株CL107菌絲生長和孢子形成具有一定的影響（如圖3所示）。當(dāng)培養(yǎng)溫度介于10～32℃之間時，菌株CL107菌絲能正常生長和形成分生孢子;當(dāng)培養(yǎng)溫度大于等于35℃時，菌株CL107停止生長且無分生孢子形成;當(dāng)培養(yǎng)溫度為28℃ 時，菌株生長最快且產(chǎn)孢量最高，產(chǎn)孢量顯著高于其余8個溫度處理（P<0.05）。

2.3.3 pH對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

不同pH的培養(yǎng)環(huán)境對菌株CL107菌絲生長和孢子形成具有一定的影響（圖4）。pH介于4.0～11.0之間，菌株CL107均能正常生長且形成分生孢子，當(dāng)pH=8.0時菌株菌絲生長最快且產(chǎn)孢量最高，其產(chǎn)孢量顯著高于其他pH處理（P<0.05）。

2.3.4 光照對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

如表2所示，不同光照條件對菌株CL107菌絲生長和孢子形成影響顯著（P<0.05）。全黑暗條件有利于菌株菌落的生長和分生孢子的萌發(fā)，光照黑暗交替條件下菌株生長和產(chǎn)孢量顯著高于全光照條件。

2.3.5 碳、氮源對菌株菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

Czapek培養(yǎng)基添加不同碳、氮源后，能顯著促進(jìn)菌株CL107菌絲生長和孢子萌發(fā)，不同碳、氮源對菌株CL107菌絲生長和孢子形成均有影響（圖5、圖6）。菌株CL107在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上菌落生長最快且產(chǎn)孢量最高，產(chǎn)孢量顯著高于其余6個不同碳源處理（P<0.05）;在以酵母提取物為氮源的培養(yǎng)基上菌落生長最快，以牛肉膏為氮源的培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最高，且均顯著高于其余6個不同氮源處理（P<0.05）。此外，在有機(jī)氮源平板培養(yǎng)基上菌株菌絲生長和分生孢子形成均顯著高于無機(jī)氮源平板培養(yǎng)基。

3 討論

擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis sp.是一類重要的植物致病菌，主要分布在全球熱帶和亞熱帶地區(qū)，在我國大多分布于南方[23-24，26]。據(jù)文獻(xiàn)報道，Pestalotiopsis sp.的寄主范圍十分廣泛，可寄生超過50多個科的植物，對閩楠Phoebe bournei [17]、紅海欖Rhizophora stylosa [27]、芒果[28]、楊梅[29]、藍(lán)莓[30]、草莓[31]、番石榴[32]等生態(tài)作物和經(jīng)濟(jì)作物為害比較嚴(yán)重。植物受此類病原物危害后常表現(xiàn)為葉斑、葉枯、腐爛、潰瘍等癥狀，嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[33-34]。本研究通過形態(tài)特征觀察和ITS、tub2、tef1多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，將稻曲擬盤多毛孢Poryzae確定為滇重樓葉斑病病原物，這也是國內(nèi)外關(guān)于稻曲擬盤多毛孢侵染滇重樓并引起葉斑病的首次報道。目前，國內(nèi)外尚未有關(guān)于稻曲擬盤多毛孢生物學(xué)特性的研究報道，因而就菌株生長及產(chǎn)孢的最適條件而言，不同的稻曲擬盤多毛孢菌株其生物學(xué)特性存在一定的相似性和差異性。這可能是由于稻曲擬盤多毛孢寄主或地域性的差異所決定的，同時也可能與稻曲擬盤多毛孢不同生理型的生物學(xué)特性差異有關(guān)，還需進(jìn)一步研究探討。

滇重樓白霉病主要危害葉片，發(fā)病初期葉片上形成近圓形或不規(guī)則的水漬狀灰褐色病斑，后期逐漸變?yōu)楹诤稚“?，且病斑上附著白色霉?當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境較潮濕時，病斑正反面有灰白色霉層，即為病原物的分生孢子堆，且葉片背面較多[4，9]。滇重樓褐斑病也主要侵染葉片，且大多從葉緣或葉尖處開始侵染，發(fā)病初期，葉片上有黃綠色水漬狀不規(guī)則病斑，其后逐漸變?yōu)闇\褐色，病斑具輪紋，發(fā)病嚴(yán)重時病斑連片且葉片邊緣枯黃卷縮;當(dāng)培養(yǎng)環(huán)境較潮濕時，病斑上有少量灰綠色小點(diǎn)，即為病原物的分生孢子堆[9]。本研究中，滇重樓受稻曲擬盤多毛孢侵染后，病斑中心發(fā)白，具明顯輪紋且葉片背面附著灰色霉層，分生孢子堆為黑色，這與以往報道的白霉病和褐斑病有很大的差別。經(jīng)田間調(diào)查及取樣分析后可知，由稻曲擬盤多毛孢侵染引起的滇重樓葉斑病發(fā)病率在7%～12%之間，發(fā)病程度較低，零星發(fā)生，主要分布在環(huán)境較潮濕的低洼地塊，先后在麗江市玉龍納西族自治縣5個不同規(guī)模滇重樓種植基地發(fā)現(xiàn)此病害。

據(jù)單孢菌株CL107的致病性測定和生物學(xué)特性測定結(jié)果可知，潮濕且中高溫環(huán)境條件有利于菌絲生長和分生孢子形成，表明高溫潮濕是該病害危害的主要環(huán)境因素。云南省麗江市玉龍納西族自治縣是滇西北重要的云藥之鄉(xiāng)，也是我國滇重樓的重要產(chǎn)區(qū)之一，種植面積大，產(chǎn)量品質(zhì)高，經(jīng)濟(jì)效益好。玉龍納西族自治縣屬于低緯度高原南亞季風(fēng)氣候，夏季氣溫介于10～26℃之間，濕潤多雨，屬稻曲擬盤多毛孢適宜生長繁殖的地區(qū)，因此滇重樓葉斑病發(fā)生流行的潛在風(fēng)險較高。全黑暗條件有利于菌株CL107菌絲生長和分生孢子的形成，透光性差、種植密度高的苗圃有利于滇重樓葉斑病的發(fā)生流行。綜上所述，滇重樓種子育苗時，應(yīng)合理控制好播種密度，保持幼苗透光通風(fēng)率，必要時適度噴灌控制苗圃內(nèi)的濕度。此外，滇重樓葉斑病發(fā)病時病原物大多從氣孔處開始侵染，嚴(yán)重時整個葉片形成深褐色不規(guī)則病斑，葉子背面常附著灰色霉層，老葉受害較為嚴(yán)重，而前期新葉的發(fā)病率相對較低，后期則新葉發(fā)病較為嚴(yán)重，這與室內(nèi)滇重樓致病性測定結(jié)果一致。種植業(yè)生產(chǎn)過程中，夏季高溫多雨，苗圃內(nèi)濕度較大，此時滇重樓正處于生長旺盛時期，也是葉斑病的高發(fā)期，應(yīng)合理調(diào)控滇重樓的種植密度和苗圃的溫濕度，改善植株的透光性和通氣度，必要時需科學(xué)合理地噴灑殺菌藥劑，預(yù)防葉斑病的發(fā)生流行，保證滇重樓種植產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定綠色發(fā)展。

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（責(zé)任編輯：田 喆）