楊雯 張志想 李世訪

摘要 近年來，我國梨樹根癌病多有發(fā)生，危害嚴(yán)重，但病原尚不明確。本研究采集了河南商丘和甘肅慶陽梨樹根瘤，共分離得到13個(gè)分離物，對其進(jìn)行形態(tài)特征觀察、序列分析和特異性PCR檢測、生理生化測定和致病性測定。結(jié)果表明，這13個(gè)分離物在NA平板上的菌落呈白色、圓形，單菌落中間凸起、邊緣整齊。它們均能在New Kerr培養(yǎng)基上良好生長。其16S rRNA基因序列與GenBank中已登錄的Agrobacterium tumefaciens和A.rhizogenes序列相似性大于98%。將分離物人工接種向日葵后能使接種部位產(chǎn)生癌瘤。鑒定結(jié)果表明，梨樹根瘤中分離出的13個(gè)分離物均為生物Ⅱ型土壤桿菌。

關(guān)鍵詞 根癌病; 梨樹; 病原菌

中圖分類號： S 436.612

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2019420

Abstract In recent years， pear crown gall occurred frequently and caused serious damage in China， but the pathogen of this disease is still unclear. Thus， we collected the root nodules of pear from Shangqiu in Henan province and Qingyang in Gansu province to identify the pathogen of pear crown gall in these areas. Total of 13 isolates were obtained and then morphological observation， sequence analysis and specific PCR detection， physiological and biochemical assay and pathogenicity determination were performed. The colonies of these 13 isolates on the NA plate were white， round and middle convex， and had neat edges. All the isolates grew well on New Kerr medium. Their 16S rRNA sequences had high similarity （>98%） with those of Agrobacterium tumefaciens and A.rhizogenes registered in GenBank. Bioassays on sunflower seedlings indicated that all these isolates infected sunflower seedlings and stimulated gall formation at the inoculation site. In a word， these 13 isolates from the root nodules of pear tree were all Agrobacterium type Ⅱ.

Key words crown gall; pear; pathogen

根癌病又稱根瘤病、冠癭病，是由根癌土壤桿菌屬Agrobacterium spp. 的致病菌引起的根部細(xì)菌性病害。該屬病原菌可侵染多種果樹如桃、蘋果、梨、櫻桃、葡萄等[1]，使植物的根及根頸部位形成大小不等的癌瘤。癌瘤初期幼嫩，呈乳白色或略帶紅色，柔軟光滑;后期木質(zhì)化而變得堅(jiān)硬，呈褐色，表面粗糙或凹凸不平，嚴(yán)重時(shí)整個(gè)主根變成一個(gè)大癌瘤[2-3]。果樹患病后，側(cè)根減少，水分養(yǎng)分運(yùn)輸受阻，葉薄色黃。發(fā)病晚期，由于病株的根部對水分和養(yǎng)料吸收差，樹勢衰弱，落花落果，嚴(yán)重時(shí)整株干枯死亡[1]。

根據(jù)生理、生化及致病性特征，根癌土壤桿菌屬可分為3種生物型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[4-6]。桃樹根癌病病原菌主要是生物Ⅰ型和Ⅱ型[7-8];櫻桃根癌病病菌大部分屬于生物Ⅱ型，少部分為生物Ⅰ型[9];對山東蘋果根癌病致病菌進(jìn)行系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)，大部分為生物Ⅱ型，少數(shù)為生物Ⅰ型[10]。葡萄根癌病病原菌生理生化上有別于Ⅰ型和Ⅱ型，被單獨(dú)列為生物Ⅲ型。我國葡萄根癌病病原菌主要為Ⅲ型[11]。

近年來，我國梨樹根癌病多有發(fā)生，危害嚴(yán)重。然而我國梨樹根癌病病原菌及其生物型尚無報(bào)道。本研究調(diào)查和采集河南商丘、甘肅慶陽梨樹根瘤，對病原菌進(jìn)行檢測和鑒定，明確兩個(gè)地區(qū)根癌病的病原菌及其生物型，為根癌病的防控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年3月-4月，采集8份梨樹根瘤，其中2份來自河南商丘，6份來自甘肅慶陽。

1.2 培養(yǎng)基及主要試劑

D1M選擇性培養(yǎng)基：NH4Cl 1.0 g，纖維二糖50 g，K2HPO4·3H2O 3.0 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，NaH2PO4·H2O 1.0 g，孔雀綠0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為 7.0～7.2。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，葡萄糖10 g，牛肉浸膏3.0 g，酵母浸粉1.0 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0。

NB培養(yǎng)液：不含瓊脂，其他同NA培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯提取物 200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0。

New Kerr培養(yǎng)基：赤鮮醇5.0 g，NaNO3 2.5 g，KH2PO4 0.1 g，NaCl 0.2 g，CaCl2 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，F(xiàn)eEDTA 2.0 mL，生物素2.0 μg，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0，放線菌酮250 μg/mL，亞硒酸鈉100 μg/mL。

2% NaCl LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母浸粉3 g，NaCl 20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0。

3-酮培養(yǎng)基：乳糖10 g，酵母浸膏1 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH為7.0。

PCR及電泳相關(guān)試劑和儀器：2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技（北京）有限公司;1.1×T3 Super PCR Mix，擎科生物技術(shù)公司;BIO-RAD MyCycle儀，Bio-Rad公司;DYY-6C電泳儀，北京六一生物科技有限公司;KCBIO-2008凝膠成像系統(tǒng)，北京原平皓生物技術(shù)有限公司。

1.3 病原菌的分離和純化

用清水將根瘤沖洗干凈，自然風(fēng)干后用75%乙醇擦拭表面消毒。剝?nèi)ケ韺铀劳鼋M織，用無菌刀片從不同方位切取內(nèi)部幼嫩白色或粉紅色的組織2～3塊，并切成2 mm×2 mm大小。將其放入75%乙醇中浸泡15 s，然后用無菌水沖洗2次，放入2 mL離心管中。加入1.5 mL無菌水，用滅菌玻璃棒搗碎。浸泡15～30 min后，取100 μL浸泡液涂布于D1M選擇性培養(yǎng)基。28℃培養(yǎng)2～4 d，挑取單菌落于NA平板上劃線純化。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 16S rRNA 基因序列分析

挑取單菌落于裝有NB培養(yǎng)液的1.5 mL離心管中，28℃，180 r/min培養(yǎng)18～24 h，利用細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物27F/1492R[12]進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。25 μL的反應(yīng)體系中包括：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物27F和1492R各1 μL，ddH2O 9 μL，菌液1.5 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min，54℃退火45 s，72℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳、回收純化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。在NCBI上利用BLAST與GenBank中已注冊的序列進(jìn)行相似性比對。

1.4.2 T-DNA區(qū)和Vir區(qū)特異性分子鑒定

利用根癌土壤桿菌質(zhì)粒上T-DNA區(qū)和Vir區(qū)特異性引物對菌液的特定序列進(jìn)行PCR檢測。T-DNA區(qū)引物為Tip6F/Tip6R[13]，Vir區(qū)引物為VirD2A/VirD2C[14]。PCR反應(yīng)體系為15 μL：1.1×T3 Super PCR Mix 13.2 μL，上、下游引物各0.6 μL，模板DNA 0.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3 min;98℃變性10 s，56℃退火 10 s，72℃延伸 10 s，共35個(gè)循環(huán);72℃延伸 2 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 病原菌生理生化鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：依據(jù)根癌菌的不同生物型在New Kerr培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基上生長形態(tài)的不同，初步鑒定生物類型。在New Kerr培養(yǎng)基上，只有生物Ⅱ型能生長良好[15];PDA培養(yǎng)基上，生物Ⅰ型生長良好、黏液多，生物Ⅱ型生長差、甚至不長，生物Ⅲ型生長好、不產(chǎn)生黏液[16]。

3-酮測定[17]：將菌株在3-酮培養(yǎng)基上點(diǎn)接，涂抹成約1 cm直徑的小斑點(diǎn)，28℃培養(yǎng)3～4 d。培養(yǎng)好的平板上倒一薄層Benedict試劑，室溫靜置，觀察是否產(chǎn)生黃色暈圈。生物Ⅰ型能產(chǎn)生明顯黃色暈圈，而生物Ⅱ型、生物Ⅲ型不變色。

35℃生長試驗(yàn)[16]：利用接種環(huán)蘸取菌液點(diǎn)接在NA平板上，35℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌株生長情況。生物Ⅰ型能在35℃條件下生長良好，而生物Ⅱ型、生物Ⅲ型生長差甚至不生長。

2% NaCl LB培養(yǎng)試驗(yàn)[16]：利用接種環(huán)蘸取菌懸液點(diǎn)接于2% NaCl LB平板上，28℃培養(yǎng)2～3 d，觀察菌株生長情況。生物Ⅰ型、生物Ⅲ型能在2% NaCl LB培養(yǎng)基上生長良好，而生物Ⅱ型對2% NaCl不耐受。

1.6 致病性測定

利用向日葵作為指示植物，測定分離菌株的致病性。用無菌水沖洗平板上培養(yǎng)的菌株，將其濃度調(diào)至109 cfu/mL（OD600=1）。在約10 cm高的向日葵幼苗的莖部，用無菌刀片劃10條約0.5 cm長的傷口，將其用蘸取菌液的無菌脫脂棉包裹住，外面再用封口膜包住。48 h后去除包裹，14 d后觀察癌瘤產(chǎn)生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離

從梨樹根瘤中共分離菌株13個(gè)，其中9個(gè)來自河南商丘，4個(gè)來自甘肅慶陽。在NA平板上，這13個(gè)菌株的菌落均呈白色、圓形，單菌落中間凸起，邊緣整齊，正反面顏色一致（圖1）。

2.2 16S rRNA基因序列分析

利用16S rRNA基因通用引物27F/1492R，對分離得到的13株菌進(jìn)行擴(kuò)增，可以得到1.5 kb左右的片段。測序（表1）及序列分析結(jié)果表明，分離自河南商丘梨樹的9株菌與A.rhizogenes（NR_113607）的序列相似性最高，大于98%;分離自甘肅慶陽梨樹的4株菌與A.tumefaciens（NR_041396）的序列相似性最高，也大于98%。由此可知，這13株菌屬于土壤桿菌屬。

2.3 T-DNA區(qū)和Vir區(qū)分子鑒定

利用根癌土壤桿菌的T-DNA區(qū)和Vir區(qū)特異性引物對分離的13個(gè)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)這13株菌均能擴(kuò)增出特異性條帶，大小分別為243 bp（引物Tip6F/Tip6R）（圖2a）和224 bp（引物VirD2A/VirD2C）（圖2b）。同時(shí)具有T-DNA區(qū)和Vir區(qū)的土壤桿菌屬細(xì)菌能夠?qū)е鹿麡涓龅漠a(chǎn)生，試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，獲得的13株菌為能引發(fā)根癌病的土壤桿菌屬細(xì)菌。

2.4 生理生化鑒定

對分離的13株菌進(jìn)行3-酮試驗(yàn)、2% NaCl LB培養(yǎng)、35℃生長試驗(yàn)以及在New Kerr和PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇性培養(yǎng)等生理生化測定。結(jié)果表明，與左側(cè)生物Ⅰ型對照相比，這13株菌在含3-酮的培養(yǎng)基上不產(chǎn)生黃色暈圈（圖3a）;對2% NaCl不耐受，因?yàn)樵?% NaCl LB培養(yǎng)基中難以生長（圖3b）;35℃條件下，在NA培養(yǎng)基上難以生長（圖3c）。此外，這13株菌均能在New Kerr培養(yǎng)基上生長（圖3d）。這些結(jié)果符合生物Ⅱ型土壤桿菌的生理生化特征。由此可知，這13株菌應(yīng)該均為生物Ⅱ型根癌土壤桿菌。

2.5 致病性測定

將分離的13株菌分別接種指示植物向日葵。從圖4可知，接種14 d后，接種的向日葵的莖部均產(chǎn)生了明顯的癌瘤，大小約為5 mm×5 mm，病情指數(shù)均約為83。取癌瘤組織再次進(jìn)行分離鑒定，結(jié)果表明，可以從中分離出土壤桿菌。這表明，所獲得的13株菌均具有致病性。

3 討論

近年來，梨樹根癌病在一些產(chǎn)區(qū)時(shí)有發(fā)生，對生產(chǎn)造成了顯著的影響[18]。病原鑒定是病害防控的前提，但目前國內(nèi)外對梨樹根癌病檢測報(bào)道較少，我國梨樹根癌病的病原尚未有系統(tǒng)的分離鑒定。為此，我們采集了河南商丘和甘肅慶陽共8份梨樹根瘤進(jìn)行分離鑒定，確定梨樹根癌病病原菌。

本試驗(yàn)從梨樹根瘤中共分離出13株細(xì)菌，通過形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定確定為根癌土壤桿菌，接種指示植物向日葵均能夠引發(fā)癌瘤。通過3-酮、2%NaCl等生理生化試驗(yàn)鑒定13株病原菌均為生物Ⅱ型。Kerr等[19]對希臘不同城市梨樹根癌病病原菌進(jìn)行分離鑒定，分離出的5株病原菌均屬于生物Ⅱ型的放射根癌土壤桿菌，與本文結(jié)果一致，且鑒定出5株生物Ⅱ型病原菌對土壤桿菌素84敏感。

對于果樹根癌病的防治，主要包括選育抗病品種、物理切除、化學(xué)藥劑防治、生物防治4個(gè)方面。目前，最有效的方式為利用生防菌劑K84進(jìn)行根癌病的生物防治，并且已經(jīng)在桃、櫻桃等果樹根癌病防控中取得較好成效[20]。K84防治根癌病主要通過生態(tài)位競爭及產(chǎn)生土壤桿菌素84殺死病原菌[2]，Kerr等試驗(yàn)證明梨樹根癌病病原菌對土壤桿菌素84敏感[19]，因此，可利用K84對我國梨樹根瘤分離出的菌株進(jìn)行敏感性測試，進(jìn)一步驗(yàn)證K84是否對我國梨樹根癌病具有防控作用。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）