冉紹云

(鄭州市第一人民醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

皰疹性咽峽炎(Herpangina,HA)是較為多見(jiàn)的傳染性疾病，以人腸道病毒(HEVs)感染為主，發(fā)熱、咽痛、咽部皰疹是其主要臨床表現(xiàn)。該病多見(jiàn)于嬰幼兒，全年均可發(fā)生，傳染性強(qiáng)，易爆發(fā)流行[1]。絕大部分病例癥狀輕微，具有自限性，但少數(shù)病例病情會(huì)迅速惡化，可發(fā)展為重癥，嚴(yán)重時(shí)危及生命，即使存活也常會(huì)遺留嚴(yán)重后遺癥[2]。近年來(lái)，HA在全球范圍內(nèi)廣泛流行，國(guó)內(nèi)多個(gè)城市已經(jīng)發(fā)生爆發(fā)疫情[3,4]。然而，由于HA在國(guó)內(nèi)并非法定傳染病，相關(guān)研究報(bào)道尚少，尤其對(duì)其病原學(xué)的研究缺乏。因此，為了解本地區(qū)HA的病原學(xué)特征，本研究對(duì)238份HA糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年2月～2018年12月由鄭州市第一人民醫(yī)院送檢的HA病例糞便樣本238份，所有標(biāo)本均于冷藏條件下送檢。

1.2 提取病毒RNA

以無(wú)菌棉簽采集糞便樣本，放置在離心管(含有Hanks平衡鹽酸溶液600μL)中，再將離心管置于旋渦混合器中，予以振蕩，充分搖勻，再取8 000 g離心處理5 min。采集上清液約200 mL，采用High Pure Viral RNA kit試劑盒(Roche公司)進(jìn)行病毒DNA提取，嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 RT-PCR

采用碩世公司腸道病毒通用型、柯薩奇病毒A16(CVA16)和EV71熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行樣本RNA檢測(cè)。RT-PCR反應(yīng)體系：去RNA酶水3.5μL，酶混合液5μL，核酸擴(kuò)增反應(yīng)液7.5μL。

1.4 RT-snPCR

以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將未分型的其他腸道病毒陽(yáng)性樣本的病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。行A組腸道病毒半巢式RT-PCR擴(kuò)增，以HEVAS1495及HEVA2C作為首輪引物，以HEVAS1495及HEVAR2807作為次輪引物[5]。對(duì)A組腸道病毒VP1全基因篩查未能檢查的樣本，進(jìn)一步行腸道病毒篩查，首輪引物采用224及222，次輪引物為AN89及AN88[6]。采用1.2%瓊脂糖凝膠110V對(duì)RT-snPCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，處理30min后進(jìn)行觀察，如檢測(cè)結(jié)果和預(yù)期片段相符，則判定屬于陽(yáng)性。產(chǎn)物序列測(cè)定：(1)HEVAS1495：序列為5'-CAGTCTTCATCAGTTACCCTG-GTIATICCITGGATIAGYAACAC-3'，基因區(qū)域?yàn)閂P3，位置2192-2236；(2)HEVAR2C：5'-CGGTGYTTGCTCTTGAACTG-CATG-3'，基因區(qū)域?yàn)?C，位置4409-4432；(3)HEVAR2807：序列為5'-CAGTTACACCGGGCAATCGTGT-CRCAICCYTGIGCIGTRG-3'，基因區(qū)域?yàn)?A，位置3502-3463；(4)224：序列為5'-GCIATGYTIGGIACICAYRT-3'，基因區(qū)域?yàn)閂P1，位置1977-1996；(4)222：序列為5'-CICCIGGIGGIAYRWACAT-3'，基因區(qū)域?yàn)閂P1，位置2969-2951；(5)AN89：序列為5'-CCAGCACTGACAGCAGYN-GARAYNGG-3'，基因區(qū)域?yàn)閂P1，位置2602-2627；(6)AN88：序列為5'-TACTGGACCACCTGGNGGNAYR-WACAT-3'，基因區(qū)域?yàn)閂P1，位置2977-2951。

1.5 生物信息學(xué)獲取

行測(cè)序結(jié)果比對(duì)(BLAST工具)。行序列作剪切處理(Bioedit軟件)，并行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。參考毒株序列統(tǒng)一來(lái)源于NCBI的GenBank。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR結(jié)果

238份HA病例標(biāo)本經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)顯示，共204例腸道病毒陽(yáng)性，陽(yáng)性率為87.39%(208/238)；其中EV71占1.92%(4/208)，CA16占20.19%(42/208)，其他腸道病毒占77.88%(162/208)。

2.2 RT-snPCR結(jié)果

162份其他病毒陽(yáng)性標(biāo)本經(jīng)RT-snPCR擴(kuò)增，電泳顯示特異性條帶159份，陽(yáng)性率為98.15%(159/162)。所有特異性條帶均測(cè)序成功。通過(guò)BLAST對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，鑒別出CA2、CA5、CA6及CA10四種病毒，分別占樣本總數(shù)的21.85%(52/238)、4.20%(10/238)、29.83%(71/238)、10.92%(26/238)。

2.3 生物信息學(xué)分析

將本組測(cè)得的CA6、CA2序列和下載的參考序列(CA6序列41例，CA2序列25例)共同構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，參考株序列源自GenBan。以VP1基因?yàn)榛A(chǔ)構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，從2017年～2018年該地區(qū)HA病例中分離的CA6病毒株都屬于B基因型。這和國(guó)內(nèi)其他地區(qū)近年分離的B基因型較近，而和國(guó)外結(jié)果基因分屬不同。序列同源性分析顯示，71株CA6序列VP1區(qū)核苷酸、氨基酸同源性分別為95.8%～100%、97.5%～100%，52株CA2毒株間核苷酸及氨基酸同源性分別為91.2%～99.2%、92.6%～100%。進(jìn)化樹(shù)和近年深圳、上海、香港分支屬于同一支，且和香港2012年的CA2流行株高度相似，核苷酸及氨基酸同源性分別為90.8%～99.7%、91.9%～100%。

3 討論

既往報(bào)道顯示，A組腸道病毒感染所致的HA癥狀通常較為輕微，但近年也有研究報(bào)道，該組病毒感染也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重并發(fā)癥，同時(shí)HA可增加手足口病聚集風(fēng)險(xiǎn)[3，7]。然而目前HA尚未受到足夠重視，防控方面仍存在諸多不足。加強(qiáng)HA的監(jiān)測(cè)對(duì)兒童健康成長(zhǎng)有著重要意義。

本組監(jiān)測(cè)的HA病例糞便標(biāo)本中，共發(fā)現(xiàn)6種類(lèi)型病變體，即CA2、CA5、CA6、CA10、CA16及EV71，它們都?xì)w屬于A組腸道病毒，未發(fā)現(xiàn)其他組腸道病毒，與既往報(bào)道一致[8]。法國(guó)2010年的報(bào)道顯示HA病例主要流行株為CA6及CA10為HA病例主要流行株[9]，泰國(guó)2012年為CA6和CA8[10]。本研究顯示，CA6是導(dǎo)致HA發(fā)生的主要流行株，CA2次之，這可能是區(qū)域差異引起的，但柯薩奇病毒為主要病原。

本研究采用擴(kuò)增VP1全序列法對(duì)HA病例中CA6遺傳進(jìn)化予以分析發(fā)現(xiàn)，CA6序列VP1區(qū)核苷酸同源性為95.8%～100%，氨基酸同源性為97.5%～100%，和國(guó)內(nèi)近年報(bào)道的B基因病毒株一致性較高。CA6近年來(lái)在多個(gè)地區(qū)活躍度越來(lái)越高，逐漸成為腸道病毒的主要流行株，逐漸取得了EV71及CA16[11]。隨著感染人數(shù)不斷增多，腸道病毒CA6基因突變的幾率也會(huì)隨之增大，而隨著變異的日積月累，其越可能出現(xiàn)爆發(fā)流行。故應(yīng)加強(qiáng)CA6的監(jiān)測(cè)。前期報(bào)道顯示，CA2所致感染癥狀多輕微，以HA為主[4]。但香港于2012年發(fā)生了CA2感染患兒死亡的病例[12]。而本研究中CA2毒株和上述香港報(bào)道的CA2毒株屬同分支，有著密切的進(jìn)化關(guān)系，核苷酸同源性為90.8%～99.7%，氨基酸同源性為91.9%～100%。鑒于CA2病毒感染也可引起嚴(yán)重事件，故也有必要加強(qiáng)CA2監(jiān)測(cè)。

綜上所述，對(duì)于HA監(jiān)測(cè)，不僅需重視EV71、CA16之外腸道病毒的監(jiān)測(cè)，還需針對(duì)CA6型進(jìn)行分型鑒定，并且應(yīng)加強(qiáng)CA2重組毒株的監(jiān)測(cè)，以為該地區(qū)的防控提供指導(dǎo)。