★ 郭明飛 高家榮 王建青 姜輝 方朝暉 魏良兵（.安徽醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院 合肥 300；.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 合肥 3003）

2型糖尿?。═ype 2 Diabetes Mellitus，T2DM）是以高血糖伴有胰島細(xì)胞分泌不足而引起的內(nèi)分泌紊亂性疾?。?-2］。持續(xù)的高血糖會(huì)誘發(fā)高血壓、高血脂以及糖尿病血管病變等一系列并發(fā)癥的發(fā)生。黃地安消膠囊由葛根、麥冬、黃連、生地等六味中藥組成，前期藥學(xué)及藥理學(xué)研究已證實(shí)其具有改善GK大鼠FBG，HbA1c、FINS等作用［3］，且質(zhì)量穩(wěn)定［4］。但其對(duì)調(diào)節(jié)胰島素耐量及骨骼肌IRS-1蛋白的調(diào)控作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)選用自發(fā)性T2DM模型GK大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，研究黃地安消膠囊對(duì)GK大鼠胰島素耐量，胰腺細(xì)胞表達(dá)以及 IRS-1基因的調(diào)節(jié)作用，探討其治療糖尿病癥狀的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 動(dòng)物 8～9周齡SPF級(jí)GK大鼠，雄性，體質(zhì)量（220±10）g，來源于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，合格證號(hào)：SCXK（滬）2012-0002。8～9周齡SPF級(jí)Wistar大鼠，雄性，體質(zhì)量（220±10）g，來源于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（皖）2011-002。

1.1.2 藥物 黃地安消膠囊為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院治療糖尿病的院內(nèi)制劑，按處方稱取適量藥材，加10倍量水加熱提取1.5 h，倒出濾液后加8倍量水繼續(xù)加熱提取1 h，合并濾液，靜止24 h后濾去殘?jiān)?，濾液經(jīng)濃縮干燥后制得干浸膏樣品以備用。參芪降糖顆粒，魯南厚普制藥有限公司，批號(hào)00115257。

1.1.3 試劑 熒光定量PCR試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］；RIPA裂解液、DAPI 染色液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（均購自杭州碧云天生物技術(shù)研究所）；DAB辣根過氧化物酶顯色試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；蘇木素染液（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.1.4 儀器 GA-3型血糖儀（三諾生物傳感股份有限公司）；D3024R臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（DragonLab公司）； RM2016病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司）；JJ-12J全密封自動(dòng)脫水機(jī)、JB-P5石蠟包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；正置熒光顯微鏡（Nikon Eclipse C1）；7500型熒光定量 PCR儀（美國ABI公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組與給藥 采用血糖儀測(cè)定GK大鼠尾靜脈血糖值，選用隨機(jī)血糖和糖負(fù)荷2 h血糖值均大于11.1 mmol/L的GK大鼠納入實(shí)驗(yàn)［5-7］。隨機(jī)分為模型組、參芪降糖顆粒組（1.08 g/kg）、黃地安消膠囊組（12，6，3 g/kg），每組10只，另取10只Wistar大鼠為對(duì)照組，每天1次，連續(xù)給藥6周。

1.2.2 胰島素耐量試驗(yàn)（ITT） 于給藥后第6周進(jìn)行胰島素耐量試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，尾靜脈測(cè)0min的血糖值，腹腔注射胰島素（0.5U/kg），測(cè)定30、60、120 min的血糖值。

1.2.3 胰腺組織病理形態(tài)學(xué)的改變 取胰腺組織放置于10%的中性甲醛溶液中固定，待檢測(cè)前取出胰腺組織，做常規(guī)石蠟包埋，并進(jìn)行HE染色，觀察胰腺組織病理損傷的程度。

1.2.4 RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)骨骼肌IRS-1 mRNA的表達(dá) 取大鼠骨骼肌組織，Trizol法提取組織總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)骨骼肌IRS-1mRNA的表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。各引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot技術(shù)檢測(cè)骨骼肌IRS-1蛋白的表達(dá) 取大鼠骨骼肌組織，勻漿，加蛋白裂解液提取總蛋白，BCA蛋白濃度試劑盒進(jìn)行定量。SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，TBST緩沖液封閉處理，加入一抗（1∶1000），4℃放置過夜，進(jìn)行二抗（1∶5000）孵育，洗膜后經(jīng)HRP-ECL發(fā)光法進(jìn)行鑒定，通過凝膠成像系統(tǒng)分析定影后蛋白條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠ITT的影響 與對(duì)照組比較，模型組GK大鼠血糖明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，黃地安消膠囊組大鼠血糖在30、60、120min時(shí)間點(diǎn)均具有降低作用，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 黃地安消膠囊對(duì)GK大鼠ITT的影響（±s，n=10） mmol/L

表2 黃地安消膠囊對(duì)GK大鼠ITT的影響（±s，n=10） mmol/L

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量g/kg 0min 30min 60min 120min對(duì)照組 - 4.68±0.65** 3.71±0.72** 3.19±0.21** 4.27±0.56**模型組 - 7.81±0.32 6.56±0. 71 5.65±1.05 6.38±0.50參芪降糖顆粒組 1.08 6.54±0.82** 5.76±0.71** 5.12±0.56 5.96±0.39黃地安消膠囊組 12 5.94±0.44** 4.95±0.67** 4.12±0.70** 5.11±0.67**黃地安消膠囊組 6 5.34±0.66** 3.95±0.49** 3.69±0.58** 4.64±0.69**黃地安消膠囊組 3 6.19±0.70** 5.24±0.63** 4.66±0.89** 5.48±0.70**

2.2 對(duì)大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響 對(duì)照組大鼠胰島組織結(jié)構(gòu)完整，與周圍界限清晰，細(xì)胞排列緊密，無明顯異常。模型組大鼠胰島細(xì)胞排列疏松，形態(tài)紊亂，與周圍組織界限模糊，胰島細(xì)胞數(shù)目較正常組降低。參芪降糖顆粒組胰島組織與周圍界限較清晰，細(xì)胞數(shù)目較模型組略有升高。黃地安消膠囊組胰島細(xì)胞形態(tài)較穩(wěn)定，排列基本規(guī)格，細(xì)胞數(shù)目較模型組具有不同程度的增加，細(xì)胞排列基本規(guī)則，結(jié)果見圖1。

圖1 黃地安消膠囊對(duì)大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)的影響（×200）

2.3 對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1 mRNA表達(dá)的影響 如圖2所示，基因IRS-1和β-actin溶解曲線分別在84℃和83℃獲得穩(wěn)定溶解峰，表明在該條件下，目的基因具有顯著的特異性。如圖3所示，由擴(kuò)增曲線結(jié)果可知，基因IRS-1和β-actin擴(kuò)增曲線跨度適中，線條光滑度適中，表明重復(fù)性良好。與對(duì)照組相比，模型組大鼠骨骼肌中IRS-1mRNA表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）；與模型組相比，黃地安消膠囊中劑量組骨骼肌IRS-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

圖2 IRS-1和β-actin溶解曲線

圖3 IRS-1和β-actin擴(kuò)增曲線

表3 黃地安消膠囊對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1 mRNA的影響（±s，n=10）

表3 黃地安消膠囊對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1 mRNA的影響（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量g/kg IRS-1對(duì)照組 - 1.00±0.05**模型組 - 0.57±0.04參芪降糖顆粒組 1.08 0.71±0.05**黃地安消膠囊組 12 0.61±0.02黃地安消膠囊組 6 0.90±0.07**黃地安消膠囊組 3 0.59±0.05

2.4 對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，模型組大鼠骨骼肌IRS-1表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，黃地安消膠囊組骨骼肌IRS-1蛋白表達(dá)具有不同程度的升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4，圖4。

表4 黃地安消膠囊對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）

表4 黃地安消膠囊對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）

注：與模型組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 劑量g/kg IRS-1對(duì)照組 - 1.31±0.06**模型組 - 0.68±0.05參芪降糖顆粒組 1.08 0.78±0.04**黃地安消膠囊組 12 0.88±0.07*黃地安消膠囊組 6 1.06±0.17**黃地安消膠囊組 3 0.77±0.05

圖4 黃地安消膠囊對(duì)大鼠骨骼肌IRS-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

T2DM是一種臨床常見的代謝紊亂性疾病，具有持續(xù)高血糖的顯著特征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，多與遺傳、自身免疫、飲食、藥物等因素有關(guān)［8］。本實(shí)驗(yàn)選用自發(fā)性2型糖尿病模型GK大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，其具有餐后血糖升高顯著，空腹血糖升高不明顯特點(diǎn)，同時(shí)具有和人類糖尿病相似的胰島素抵抗，糖耐量降低等特征，已成為研究T2DM的理想模型［9-10］。由該處方比例可知成人每日所需生藥量為51 g，由人、鼠體表面積換算比例得出大鼠每日所需生藥量為4.59 g，每克浸膏所含生藥量為3.06 g，故黃地安消膠囊高，中，低劑量組浸膏量為（12、6、3 g/kg）相當(dāng)于臨床劑量的8、4、2倍。

胰島素作為體內(nèi)唯一的降糖激素，由胰島細(xì)胞分泌，對(duì)維持血糖穩(wěn)定，促進(jìn)機(jī)體正常生理功能具有至關(guān)重要的作用。胰腺組織損傷會(huì)直接引起胰島細(xì)胞功能降低，胰島素分泌的減少，進(jìn)而促進(jìn)高血糖的發(fā)生。病理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃地安消膠囊能夠促進(jìn)胰腺組織細(xì)胞表達(dá)，改善胰島細(xì)胞功能，促進(jìn)胰島素分泌，緩解高血糖狀態(tài)。ITT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，各給藥組血糖均呈先降低后升高的趨勢(shì)，表明黃地安消膠囊對(duì)胰島素的利用率均存在一定程度的改善，促進(jìn)了胰島素的分泌。IRS-1是胰島素信號(hào)傳遞的關(guān)鍵蛋白分子，廣泛的分布于骨骼肌、肝臟、脂肪等組織，其直接決定著胰島素與細(xì)胞膜受體底物結(jié)合的強(qiáng)弱［11］。在正常大鼠體內(nèi)，IRS-1酪氨酸位點(diǎn)易發(fā)生磷酸化效應(yīng)而活化，促進(jìn)下游PI3K/Akt信號(hào)通路的激活，引發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，增加肌糖原，肝糖原的生物合成，加強(qiáng)機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收和利用，降低血糖含量［12-13］。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)高血糖狀態(tài)時(shí)，各組織器官IRS-1蛋白表達(dá)明顯降低，與胰島素的結(jié)合受阻，出現(xiàn)胰島素信號(hào)通路傳遞被抑制，引發(fā)外周組織對(duì)葡萄糖消耗量的減少，從而加重糖尿病癥狀［14］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)骨骼肌IRS-1的蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)黃地安消膠囊能夠促進(jìn)GK大鼠骨骼肌IRS-1mRNA和蛋白表達(dá)，有利于胰島素與其相應(yīng)受體相結(jié)合，增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路的傳遞，從而降低血糖水平，改善糖尿病癥狀。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃地安消膠囊對(duì)GK大鼠血糖含量具有一定的降低作用，其機(jī)制可能與黃地安消膠囊改善胰島細(xì)胞功能，促進(jìn)骨骼肌組織IRS-1蛋白表達(dá)，增加胰島素與IRS-1受體蛋白結(jié)合，增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路傳遞有關(guān)。