★ 張玉愛 郭智強 廖太祥 陳圓 黎莉萍（南昌市博澤康醫(yī)藥科技有限公司 南昌 330029）

復(fù)方蒲公英顆粒是由蒲公英、黃連、薏苡仁、茵陳等十二味中藥材制成的復(fù)方制劑，具有清泄肺胃積熱、解毒散結(jié)等功效。適用于濕熱毒蘊結(jié)所致的痤瘡，脂溢性皮炎，玫瑰痤瘡，酒渣鼻，毛囊炎等病癥。原中藥處方?jīng)]有固定的質(zhì)量標準，很難對藥品質(zhì)量進行控制，為了保障在臨床中應(yīng)用的安全，因此有必要進行相關(guān)的醫(yī)院制劑質(zhì)量標準研究［1-2］。

本文對該處方藥物進行質(zhì)量標準研究，試驗采用TLC法對處方中的蒲公英、黃連和薏苡仁進行了定性鑒別，并以鹽酸小檗堿為定量指標，研究了HPLC測定該成分的方法，并進行方法學(xué)考察，最終建立起復(fù)方蒲公英顆粒的質(zhì)量標準，保證臨床用藥的安全、有效和穩(wěn)定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 KQ2200DB型超聲波清洗機（昆山超聲波儀器有限公司）；ZF-2型紫外儀（上海安亭電子儀器廠）；BS25S型電子天平（奧豪斯儀器有限公司）；APS-80-10D型高效液相色譜儀（德國沃特斯）；硅膠G板（青島海洋化工廠）。

1.2 材料 鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200208，中國藥品生物制品檢定研究院）；蒲公英對照藥材（批號：121195-201503，中國藥品生物制品檢定研究院）；薏苡仁對照藥材（批號：121254-201504，中國藥品生物制品檢定研究院）；乙腈為色譜純；水為超純水（自制）；其它化學(xué)試劑均為分析純。復(fù)方蒲公英顆粒供試品三批（170504、170505、170506）及陰性樣品均由本公司制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜法

2.1.1 黃連的鑒別 黃連中的主要化學(xué)成分為鹽酸小檗堿［3］，故以鹽酸小檗堿進行定性鑒別。①供試品溶液：取本品10 g，研細，加乙醇30 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。②對照品溶液：再取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的對照品溶液。③黃連陰性對照品溶液：再取缺黃連藥材的復(fù)方蒲公英顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗［4］，吸取供試品溶液5 μL、陰性對照品溶液5 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7∶1∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。⑤結(jié)果：供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上顯相同的黃色熒光斑點；陰性對照色譜中，無上述斑點檢出。說明本法專屬性強，可以作為黃連的鑒別。

圖1 黃連薄層鑒別圖譜

2.1.2 蒲公英的鑒別［5］①供試品溶液：取本品10 g，研細，加乙醇30 mL，超聲處理20 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加三氯甲烷2 mL使溶解，作為供試品溶液。②對照藥材溶液：另取蒲公英對照藥材1 g，加甲醇20 mL，同法制得對照藥材溶液。③蒲公英陰性對照品溶液：再取缺蒲公英藥材的復(fù)方蒲公英顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部通則0502）試驗［4］，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液與對照藥材溶液各10～15 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10 %硫酸乙醇溶液，加熱至斑點顯色清晰。⑤結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照色譜中，無上述斑點檢出。說明本法專屬性強，可以作為蒲公英的鑒別。如圖2所示。

圖2 蒲公英薄層鑒別圖譜

2.1.3 薏苡仁的鑒別［6］①供試品溶液：取本品10 g，研細，加石油醚（60～90 ℃）20 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加石油醚1 mL使溶解，作為供試品溶液。②對照藥材溶液：另取薏苡仁對照藥材1 g，同法制得對照藥材溶液。③薏苡仁陰性對照品溶液：再取缺薏苡仁藥材的復(fù)方蒲公英顆粒內(nèi)容物10 g，按供試品溶液制備的方法制成陰性對照品溶液。④檢查方法：照薄層色譜法（通則0502）試驗［4］，吸取供試品溶液、陰性對照品溶液與對照藥材溶液各5～10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯-醋酸（10∶3∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。⑤結(jié)果：供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照色譜中，無上述斑點檢出。說明本法專屬性強，可以作為薏苡仁的鑒別。

圖3 薏苡仁薄層鑒別圖譜

2.2 復(fù)方蒲公英顆粒檢查

2.2.1 水分 按照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法測定，取同一批復(fù)方蒲公英顆粒，平行3份，測得平均含水量為4.32 %（小于8.0 %），符合要求。

2.2.2 溶化性 按照《中國藥典》2015年版四部通則0104顆粒劑溶化性項下規(guī)定，取復(fù)方蒲公英顆粒10 g，加熱水200 mL，攪拌5 min，觀察到顆粒全部溶化，符合要求。

2.2.3 粒度 按照《中國藥典》2015年版四部通則0982粒度和粒度分布測定法第二法雙篩分法測定，結(jié)果不能通過一號篩與能通過五號篩的顆?？偤蜑?.0 g（不超過15 %）。

2.2.4 裝量差異 按照《中國藥典》2015年版四部通則0104顆粒劑裝量差異項下規(guī)定（6.0 g以上，裝量差異限度為±5 %），復(fù)方蒲連顆粒三批樣品裝量差異檢測結(jié)果均在±5 %范圍內(nèi)，符合藥典項下規(guī)定。

2.2.5 微生物的檢查方法驗證 根據(jù)實際檢驗需求，從需氧菌總數(shù)計數(shù)法、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)法和控制菌檢查方法三個方面對復(fù)方蒲連顆粒微生物檢查方法進行了詳細具體的驗證，驗證結(jié)果均符合要求，證明了復(fù)方蒲連顆粒微生物檢查方法是合理有效的，所獲得的檢驗結(jié)果也是真實可靠的。

2.3 鹽酸小檗堿的含量測定

2.3.1 色譜條件［4］色譜條件：Diamonsil C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）為流動相；檢測波長為345 nm；進樣量為20 μL。在此色譜條件下，供試品中的鹽酸小檗堿與其他成分有較好的分離度，陰性樣品對指標成分含量測定無干擾。

圖4 高效液相色譜圖

2.3.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL約含20 μg的溶液，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 取裝量差異項下的本品，研細，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇：鹽酸（100∶1）混合溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用上述混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過（0.45 μm濾膜），取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 陰性對照溶液的制備 按處方比例，稱取缺少黃連的復(fù)方蒲公英顆粒的藥材，按照制備工藝配制，然后依照“2.3.3”項下的方法制備陰性對照溶液。

2.3.5 線性關(guān)系考察 精密稱取鹽酸小檗堿對照品33.0 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成0.66 mg/mL的對照品貯備液。精密量取對照品貯備液0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。吸取上述溶液，分別進樣20 μL，以測定濃度X（mg/mL）對峰面積Y進行線性回歸，得回歸方程Y=4×107X-50 694，r=0.999 6（n=7），試驗結(jié)果表明鹽酸小檗堿在0.003 42～0.068 40 mg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.6 精密度試驗 取鹽酸小檗堿對照品溶液（20 μg/mL）20 μL，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，結(jié)果對照品峰面積RSD=1.66 %，精密度良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取本品同一批號樣品6份，按2.3.3項下方法操作，分別按上述色譜條件方法進行測定鹽酸小檗堿，計算樣品含量，RSD為2.20 %（n=6），表明該含量測定方法有良好的重復(fù)性。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品溶液（170504），室溫放置，在0、2、4、6、8、12、24 h分別精密吸取20 μL測定，按上述色譜條件測定結(jié)果峰面積的RSD為1.26 %。色譜峰面積在24 h內(nèi)基本無變化，說明穩(wěn)定性好。

2.3.9 回收率試驗 取已知含量的同一批號（170504）樣品6份，研碎，分別加入鹽酸小檗堿對照品溶液（0.142 0 mg/mL）1 mL，按上述2.3.3項下制備方法配制加樣回收供試液，按上述色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 鹽酸小檗堿回收率試驗結(jié)果

2.3.10 樣品含量測定 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，按外標法計算3批中試樣品（170504、170505、170506）含量。

表2 三批樣品中鹽酸小檗堿含量測定結(jié)果

3 討論

3.1 專屬性 本試驗對處方中的黃連、桑白皮、大黃、蒲公英、薏苡仁、茵陳等進行了薄層鑒別條件摸索，發(fā)現(xiàn)桑白皮、大黃、茵陳等均有陰性干擾，因此確定了黃連、蒲公英和薏苡仁作為薄層鑒別方法，重現(xiàn)性好，結(jié)果可靠。同時參考中國藥典2015年版一部收載的黃連中鹽酸小檗堿含量測定方法，通過方法學(xué)驗證，確定了本品的含量測定方法，方法簡便，穩(wěn)定，快捷，且所測3批樣品中鹽酸小檗堿的含量穩(wěn)定，方法可行。

3.2 提取方法的選擇 對加水量、提取時間、提取次數(shù)進行了摸索及確定，進行了三因素三水平正交實驗，結(jié)果表明，提取次數(shù)對提取工藝影響最大，其次是加水量，提取時間對提取工藝影響較小。從經(jīng)濟成本、實際生產(chǎn)考慮，確定本品提取最佳工藝條件為：加水量為8倍，提取時間為2 h，提取次數(shù)為2次。

3.3 濃縮工藝考察 日常生產(chǎn)過程中，我們考察濾液濃縮的相對密度對制劑成型工藝的影響，通過將制粒過程及顆粒的性狀作為參考指標，根據(jù)實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)濾液濃縮的相對密度為1.35最適宜，考慮到實際生產(chǎn)的可操作性，將濾液濃縮的相對密度定為1.32～1.35（60 ℃）的稠膏。

3.4 制劑工藝的選擇 日常生產(chǎn)過程中，中藥顆粒劑一般采用蔗糖作為矯味劑，糊精、淀粉作為粘合劑，我們分別對其進行了考察，并以溶化性作為參考依據(jù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔗糖加糊精，溶化完全，無分層現(xiàn)象；蔗糖加淀粉，溶化性不好，出現(xiàn)少量分層現(xiàn)象。故根據(jù)實驗結(jié)果，采用蔗糖、糊精作為制劑成型輔料。根據(jù)實驗結(jié)果，加入蔗糖與糊精比例為2∶3，軟材適中，顆粒均勻。由于實際生產(chǎn)過程中藥材批次不同，出膏率不一樣，可進行適當(dāng)微調(diào)。

3.5 干燥工藝的選擇 日常生產(chǎn)過程中，我們考察干燥工藝對制劑成型工藝的影響，通過將不同干燥溫度與干燥時間來測定水分作為參考指標，實驗結(jié)果顯示，均符合2015年版《中國藥典》規(guī)定（8.0 %＜水分），根據(jù)實際生產(chǎn)情況，將干燥溫度定為60～80 ℃，干燥時間定為2～4 h，考慮到生產(chǎn)批量不同，可適當(dāng)微調(diào)。

3.6 檢測波長的選擇 采用二極管陣列檢測器對鹽酸小檗堿對照品色譜峰進行光譜掃描，結(jié)果鹽酸小檗堿在345 nm波長處有最大吸收，由于345 nm雜峰對目標峰干擾少且穩(wěn)定，故選擇345 nm作為檢測波長。

3.7 色譜條件的優(yōu)化 本實驗通過摸索乙腈-0.05 mol/L磷酸水溶液、甲醇-0.05 mol/L磷酸水溶液按一定比例混合作為流動相，考察其分離度，結(jié)果以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調(diào)節(jié)pH值為4.0）為流動相；檢測波長為345 nm，Diamonsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜條件下供試品中鹽酸小檗堿與其他共存組分峰能達到良好的分離。

本實驗建立了復(fù)方蒲公英顆粒中鹽酸小檗堿的HPLC含量測定方法。結(jié)果表明，所建立的方法操作簡便、結(jié)果可靠、重復(fù)性好。