楊立宇 郭然 牟帥 張一奇 楊禮慶 付勤

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，遼寧 沈陽(yáng) 110003

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)作為影響廣大老齡患者尤其是絕經(jīng)后人群的重要疾病之一，已經(jīng)愈發(fā)得到現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的關(guān)注。骨質(zhì)疏松癥是以鈣含量減低、骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞、骨骼強(qiáng)度、韌性衰減為特點(diǎn)，最終導(dǎo)致骨骼質(zhì)量下降,發(fā)生脆性骨折的全身骨代謝疾病[1-2]。目前臨床上抗骨質(zhì)疏松治療主要以抗骨吸收藥物為代表，如雙膦酸鹽類、降鈣素類，這類藥物雖可顯著減緩骨密度下降的程度，但是用藥同時(shí)抑制骨形成活動(dòng)，用藥后脆性骨折再發(fā)率仍較高，存在下頜骨壞死等弊端[3]。而現(xiàn)有的一些促進(jìn)骨形成藥物亦存在著潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)[4]。相比之下，傳統(tǒng)中醫(yī)藥則具備溫和安全、雙向調(diào)控等優(yōu)點(diǎn)，愈發(fā)引起現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的關(guān)注。

芍藥苷(paeoniflorin，Pa)作為傳統(tǒng)中藥白芍總苷的主要成分之一，在中醫(yī)傳統(tǒng)處方中起著抗炎、利尿的作用[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)芍藥苷除了以上功能作用之外，還具備抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等作用[6-7]。在骨質(zhì)疏松治療方面，有研究[8]表明芍藥苷可以抑制NF-κB信號(hào)通路來(lái)降低破骨細(xì)胞的分化功能、緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者骨丟失的癥狀[9-10]。但是芍藥苷對(duì)成骨分化的作用影響仍缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，本研究的目的是探討芍藥苷對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的干預(yù)作用，并觀察其對(duì)骨質(zhì)疏松小鼠模型的治療效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡C57BL/6小鼠24只(北京華阜康生物科技公司，中國(guó))。隨機(jī)將小鼠分為三組，假手術(shù)組(Sham組)、骨質(zhì)疏松模型組(OVX組)、芍藥苷干預(yù)組(OVX+Pa組)。給予Sham組僅開腹后便縫合腹膜，而OVX與OVX+Pa組則行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)。術(shù)后一周開始各組對(duì)應(yīng)干預(yù)，OVX+Pa組每日進(jìn)行芍藥苷(50 mg/kg)腹腔注射，而Sham組與OVX組則給予等體積鹽水注射，干預(yù)12周后取材。

1.1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：采用小鼠成骨前體細(xì)胞系MC3T3-E1(來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海研究院細(xì)胞庫(kù))。

1.1.3實(shí)驗(yàn)藥物：芍藥苷(Sigma-Aldrich，美國(guó))。

1.1.4實(shí)驗(yàn)試劑：α-MEM培養(yǎng)基、胰酶-EDTA、進(jìn)口胎牛血清、PBS溶液(Biological Industries，以色列)；OPG、RANKL抗體(萬(wàn)類試劑，中國(guó))；Runx2抗體(Abcam，美國(guó))；β-actin抗體、堿性磷酸酶染色試劑盒、堿性磷酸酶測(cè)定試劑盒(碧云天，中國(guó))；免疫組化二抗(中杉金橋，中國(guó))；抗原修復(fù)液(博士德生物科技，中國(guó))；DAB染色試劑盒(邁新生物，中國(guó))；HE染色液、茜素紅染色液(索萊寶，中國(guó))。EDTA脫鈣液、引物(上海生工，中國(guó))；熒光定量PCR試劑盒(Takara，日本)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)：將MC3T3-E1細(xì)胞接種于α-MEM培養(yǎng)基中，其中含10 %的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL的鏈霉素。孵箱培養(yǎng)條件設(shè)定為溫度37 ℃、氣體條件為5 % CO2，每48 h進(jìn)行換液，添加不同濃度的芍藥苷進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將MC3T3-E1細(xì)胞在96孔板中以5 000 cell/mm2的密度鋪板，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔中培養(yǎng)基的體積為100 μL。24 h后，加入不同濃度的芍藥苷干預(yù)血清，48 h后，每個(gè)復(fù)孔加入90 μL含血清培養(yǎng)基之外，再加入10 μL CCK-8檢測(cè)液，37 ℃孵箱內(nèi)進(jìn)行孵育2 h，酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek)在450 nm處測(cè)量吸光度值。

1.2.3ALP活性、染色實(shí)驗(yàn)：將MC3T3-E1細(xì)胞鋪設(shè)于6孔板中，分別向每孔中加入3 mL藥物干預(yù)血清，對(duì)照組則加入相同濃度的成骨誘導(dǎo)劑(Vitamin C 50 μg/mL、Dexamethasone 100 mmol/L和β-sodium glycerophosphate 10 mmol/L的混合液)， 每48 h換液一次，連續(xù)培養(yǎng)一周。采用150 μL的Ripa裂解液裂解細(xì)胞，離心后收集上清液作為樣品。96孔板中加入50 μL底物、30 μL緩沖液和20 μL樣品，總體積共100 μL。充分混勻后,37 ℃溫育15 min，酶標(biāo)儀測(cè)吸光度值。ALP染色則吸除原有培養(yǎng)基，PBS輕柔清洗孔底細(xì)胞2～3遍，4 %多聚甲醛室溫下固定10 min，洗滌后加入300 μL顯色液。室溫避光孵育2 h后，PBS輕柔洗滌，光學(xué)顯微鏡(Elipse Ci-L)(日本Nikon公司)觀察并照相。

1.2.4茜素紅染色實(shí)驗(yàn)：6孔板中，每孔加入不同濃度的芍藥苷干預(yù)血清和相同濃度的成骨誘導(dǎo)劑，培養(yǎng)2周，每48 h換液一次。染色步驟同ALP染色，確認(rèn)染色良好后，進(jìn)行光鏡下觀察并照相。緊接著進(jìn)行半定量檢測(cè)，每孔加入1 mL 10 %十六烷基吡啶，輕微振蕩洗脫染料后，吸取200 μL上清液加入96孔板中，每組3個(gè)復(fù)孔，采用酶標(biāo)儀540 nm測(cè)吸光度值，與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)出相對(duì)濃度。

1.2.5實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)：提取總RNA后進(jìn)行純度以及濃度檢測(cè)。確認(rèn)無(wú)誤后采用試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。于95 ℃預(yù)變性15 min，同溫度下變性20 s，于58 ℃退火30 s,在72 ℃下延伸30 s，如此反復(fù)擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。采用熒光定量PCR儀(7500 fast，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，采用β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析，每組設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers for quantitative real time PCR

1.2.6Western blot檢測(cè)：取不同濃度芍藥苷干預(yù)72 h的細(xì)胞，Ripa裂解液冰上裂解15 min，提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)蛋白樣品濃度，用蛋白上樣緩沖液稀釋每組蛋白樣品至3 μg/μL，在電泳孔道中，每組加入10 μL，而后冰水浴中轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，5 %的脫脂牛奶封閉，一抗溶液中4 ℃孵育過(guò)夜。次日室溫條件下二抗溶液中孵育2 h。輕柔加入顯影劑，采用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(C300，美國(guó)Azure)使蛋白條帶顯影，應(yīng)用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行密度分析。

1.2.7HE染色和免疫組織化學(xué)檢測(cè)：應(yīng)用石蠟切片機(jī)(Microm HM 340E，美國(guó))對(duì)標(biāo)本進(jìn)行3 μm厚度切片。二甲苯脫蠟后，不同濃度乙醇褪去二甲苯。蘇木素染色、自來(lái)水返藍(lán)后伊紅染色，蒸餾水洗去附著的染色液。顯微鏡下觀察顏色結(jié)構(gòu)良好后，脫水，二甲苯透明封片。光學(xué)顯微鏡下觀察干骺端附近骨小梁厚度以及結(jié)構(gòu)。免疫組織化學(xué)染色步驟：脫蠟后采用抗原修復(fù)液覆蓋標(biāo)本區(qū)域37 ℃孵育30 min，而后室溫下阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，一抗抗體4 ℃孵育過(guò)夜。室溫下二抗孵育30 min，與鏈霉素過(guò)氧化物酶室溫孵育20 min。滴加新鮮配制的DAB顯色液，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水返藍(lán)，脫水封片。應(yīng)用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.8micro-CT分析：頸椎脫位法后取小鼠左側(cè)脛骨，4 %多聚甲醛固定72 h，采用micro-CT(Cheetah EVO，YXLON，德國(guó))進(jìn)行掃描，掃描厚度為6～7 μm，源電壓80 kV，源電流35 μA，曝光時(shí)間選擇為720 ms。采用系統(tǒng)自帶的分析軟件對(duì)獲取圖像進(jìn)行定量分析，主要參數(shù)有骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁寬度(Tb.Th)、骨小梁間隔(Tb.Sp)以及骨小梁體積(BV)和掃描組織體積(TV)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié)果數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算，全部計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)方式，以P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度芍藥苷對(duì)體外MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響

與對(duì)照組相比，芍藥苷對(duì)體外MC3T3-E1細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(P>0.05)，見圖1。

圖1 芍藥苷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of paeoniflorin on the viability of MC3T3-E1 cells

2.2 芍藥苷促進(jìn)體外MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化

中、高劑量芍藥苷能夠明顯提升MC3T3-E1細(xì)胞ALP的表達(dá)，且高劑量干預(yù)組(20 μmol/L)效果顯著(P<0.01)。成骨分化誘導(dǎo)劑干預(yù)14 d后，高劑量組鈣結(jié)節(jié)的數(shù)量與密度明顯高于對(duì)照組，結(jié)果顯示給予芍藥苷干預(yù)能夠明顯促進(jìn)MC3T3-E1細(xì)胞的礦化能力(P<0.01)。見圖2。

圖2 芍藥苷對(duì)MC3T3-E1成骨分化能力的影響(光鏡下100倍放大)注：*P<0.05;**P<0.01。Fig.2 Effect of paeoniflorin on osteogenic differentiation of MC3T3-E1(Scale bar: 100× magnification)

2.3 芍藥苷對(duì)體外MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化基因的影響

中、高劑量芍藥苷干預(yù)組顯著提升了成骨分化基因OPG、Runx2以及Colα1的mRNA表達(dá)(P<0.05)，降低了破骨分化相關(guān)基因RANKL的mRNA表達(dá)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖3 芍藥苷對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化相關(guān)基因的影響注：*P<0.05;**P<0.01。Fig.3 Effects of paeoniflorin on genes related to osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

2.4 不同濃度芍藥苷干預(yù)后相關(guān)蛋白表達(dá)情況

高劑量芍藥苷干預(yù)組能夠顯著提升MC3T3-E1成骨分化蛋白OPG、Runx2蛋白的表達(dá)(P<0.01),降低破骨分化蛋白R(shí)ANKL蛋白的分泌(P<0.01)，見圖4。這一結(jié)果與RT-PCR結(jié)果相符合。

圖4 芍藥苷干預(yù)后成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)情況注：*P<0.05;**P<0.01。Fig.4 Expression of osteogenic differentiation related proteins after paeoniflorin intervention

2.5 HE染色和免疫組織化學(xué)分析結(jié)果

與Sham組相比，OVX組骨小梁間隔明顯增大，骨小梁變得細(xì)短而且排列稀疏；OVX+Pa組較OVX組骨小梁數(shù)量以及厚度有所增加。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Sham組中Runx2蛋白主要分布于骨小梁的表面成骨細(xì)胞內(nèi)以及干骺端附近的骨細(xì)胞陷窩中，而OVX組表達(dá)較少，OVX+Pa組有所恢復(fù)。半定量分析顯示，OVX組與OVX+Pa組較Sham組Runx2蛋白表達(dá)均顯著下降(P<0.01)，但芍藥苷組下降程度更少，與OVX組比較芍藥苷明顯提升骨質(zhì)疏松小鼠體內(nèi)的Runx2蛋白表達(dá)(P<0.01)。見圖5。

圖5 小鼠股骨遠(yuǎn)端干骺端附近骨小梁HE染色以及Runx2蛋白免疫組織化學(xué)染色情況(光鏡下200倍放大)注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，##P<0.01。Fig.5 HE staining of trabecular bone near metaphyseal of distal femur and immunohistochemical staining of Runx2 protein(Scale bar: 200× magnification)

2.6 芍藥苷對(duì)小鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

與Sham組相比，OVX組在BV/TV(骨小梁體積比)、Tb.N(骨小梁數(shù)量)、Tb.Th(骨小梁厚度)都顯著下降(P<0.01),而Tb.Sp(骨小梁間隔)顯著加寬(P<0.01)。而OVX+Pa組，Tb.Sp、Tb.Th未見明顯差異(P>0.05),BV/TV以及Tb.N較Sham組下降明顯(P<0.01)；同時(shí)OVX+Pa組與OVX組相比較，顯著提升了BV/TV(骨小梁體積比)、Tb.N(骨小梁數(shù)量)和Tb.Th(骨小梁厚度)，有效降低了Tb.Sp(骨小梁間隔)(P<0.01)。見圖6。

圖6 Sham組、OVX組和OVX+Pa組脛骨近端干骺端micro-CT分析 A：各組典型的micro-CT影像；B：各組Tb.N、Tb.Sp、Tb.Th、BV/TV的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果。注：與Sham組比較，**P<0.01；與OVX組比較，##P<0.01。各組n=8。Fig.6 Micro-CT analysis of proximal tibial metaphyseal in the Sham group, OVX group and OVX+Pa group A：Typical micro-CT images of each group; B：Statistical analysis results of Tb.N, Tb.Sp, Tb.Th and BV/TV in each group.

3 討論

骨形成與骨吸收活動(dòng)失衡，是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的重要原因。成骨細(xì)胞構(gòu)造骨組織形成活動(dòng)，而破骨細(xì)胞拆解鈣離子以及膠原組織形成骨吸收活動(dòng)[11]。成骨分化活動(dòng)主要是由成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的增殖與分化來(lái)調(diào)節(jié)[12]，而Runx2和Osterix這兩種轉(zhuǎn)化因子起到重要促進(jìn)的作用，表現(xiàn)為骨基質(zhì)蛋白的分泌增加，堿性磷酸酶(ALP)、I型膠原纖維表達(dá)量(Colα1)升高(如圖3)，這些微觀的改變進(jìn)一步促進(jìn)骨組織鈣鹽的沉積以及骨小梁的形成[13]。成骨分化通常分為兩個(gè)階段，在早期階段堿性磷酸酶作為關(guān)鍵標(biāo)志物起到作用，可以促進(jìn)相關(guān)成骨分化基因Colα1、OPN(骨橋蛋白)的表達(dá)；而在成骨分化的晚期階段特點(diǎn)是骨細(xì)胞外基質(zhì)的形成，表現(xiàn)為鈣鹽沉積在骨小梁網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中[14-15]。本研究表明芍藥苷可以有效地促進(jìn)堿性磷酸酶以及成骨分化因子的分泌，進(jìn)一步增強(qiáng)成骨細(xì)胞的礦化活動(dòng)(見圖2～圖4)，說(shuō)明芍藥苷在成骨分化的早期以及晚期均起到了促進(jìn)作用。

破骨細(xì)胞分化的進(jìn)程受到了成骨細(xì)胞所分泌的兩種重要因子-骨保護(hù)素(OPG)以及核因子κB受體活化因子配體(RANKL)的影響。核因子κB受體活化因子配體(RANKL)通過(guò)與核因子κB受體活化因子(RANK)受體結(jié)合激活并調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化的進(jìn)程[16]。而成骨細(xì)胞分泌的OPG可以阻止RANKL與RANK的結(jié)合，從而達(dá)到抑制破骨細(xì)胞增殖分化的作用。故OPG與RANKL表達(dá)比在觀察骨吸收與骨形成活動(dòng)時(shí)是一個(gè)重要的指標(biāo)[17]，通常在骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展時(shí)，即骨吸收增強(qiáng)、骨形成減弱時(shí)，這一比例大大降低；而治療的目的是增強(qiáng)骨形成，降低骨吸收，提高OPG與RANKL這一比值。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可以提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞OPG的mRNA與蛋白的表達(dá)，并減少RANKL的表達(dá)(見圖3、圖4)，改善并提高了OPG/RANKL的比值關(guān)系，在促進(jìn)成骨分化的基礎(chǔ)上一定程度地抑制了破骨細(xì)胞的分化。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證芍藥苷的抗骨質(zhì)疏松作用，本次研究進(jìn)行了骨質(zhì)疏松模型小鼠體內(nèi)驗(yàn)證。卵巢摘除模型小鼠是作為模擬原發(fā)性骨質(zhì)疏松最為可靠的模型之一[18]，能夠最大程度的反映絕經(jīng)后女性有關(guān)的臨床與生理變化，有研究[19]表明，當(dāng)卵巢摘除后低雌激素水平改變了骨細(xì)胞外的微環(huán)境，打破了既有的骨吸收/骨形成平衡，增加了骨轉(zhuǎn)換的程度，即增加破骨分化以及成骨細(xì)胞凋亡。筆者通過(guò)骨組織切片和組織免疫化學(xué)發(fā)現(xiàn)，芍藥苷可以改善骨小梁的厚度，增加干骺端附近Runx2蛋白的表達(dá)(見圖5)，說(shuō)明芍藥苷不但在體外實(shí)驗(yàn)中可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化，同樣在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到了確認(rèn)。為了進(jìn)一步定量、微觀分析，筆者進(jìn)行了micro-CT檢測(cè)。結(jié)果顯示，芍藥苷增加了檢測(cè)區(qū)域內(nèi)的骨小梁數(shù)量，厚度，并降低骨小梁之間的間隙(見圖6)。

既有的研究已表明芍藥苷可以通過(guò)抑制骨吸收活動(dòng)達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用[8]，本研究則通過(guò)體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明芍藥苷具有雙向調(diào)節(jié)作用，在抑制骨吸收的同時(shí)，直接作用于成骨細(xì)胞增加骨形成活動(dòng)，進(jìn)一步證明了芍藥苷的抗骨質(zhì)疏松作用。而最新的相關(guān)文章[11]表明，NF-κB信號(hào)通路起到了關(guān)鍵作用，芍藥苷可通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路減少破骨細(xì)胞的分化，而當(dāng)使用TNF-α干預(yù)成骨細(xì)胞上調(diào)NF-κB信號(hào)通路時(shí)，成骨分化活動(dòng)受到明顯抑制，給予芍藥苷可以緩解NF-κB信號(hào)通路的抑制作用。說(shuō)明NF-κB信號(hào)通路可能是芍藥苷的重要作用信號(hào)通路，其抗骨質(zhì)疏松的具體作用靶點(diǎn)以及分子機(jī)制，需要進(jìn)一步的深入研究。