蘇姍 楊蕓瑞 李紅利 王麗婷 甄東戶*

1.蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000

二甲雙胍(metformin, MF)被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病、代謝綜合征、非酒精性脂肪肝病等以胰島素抵抗為主的疾病的治療[1]。隨著對MF進(jìn)一步深入研究，研究者發(fā)現(xiàn)MF除具有降糖作用外，還可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨細(xì)胞分化，增加成骨細(xì)胞數(shù)目，促進(jìn)骨形成，此外MF通過激活鈣調(diào)蛋白激酶和轉(zhuǎn)化生長因子活化激酶，抑制RANKL的表達(dá)以及破骨細(xì)胞的分化，從而發(fā)揮骨保護(hù)作用[2-3]。但其作用機(jī)制錯綜復(fù)雜，目前MF對骨代謝影響的具體機(jī)制仍未完全明確。因此本研究以去卵巢大鼠模擬骨質(zhì)疏松癥，以雌二醇為對照，觀察MF對去卵巢大鼠骨密度及骨礦含量的影響，并從細(xì)胞和分子水平探討MF可能的骨保護(hù)機(jī)制，為臨床上預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

3月齡SPF級雌性健康SD大鼠60只，體重200～300 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 方法

1.2.1去卵巢大鼠模型的建立及骨密度和骨礦含量的測定：60只3月齡雌性健康SD大鼠被隨機(jī)均分4組：假手術(shù)(SHAM)組、去卵巢(OVX)組、去卵巢+二甲雙胍(OVX+MF)組和去卵巢+雌二醇(OVX+E2)組。OVX組、OVX+MF組和OVX+E2組行雙側(cè)卵巢摘除建立骨質(zhì)疏松模型，SHAM組僅切除雙側(cè)卵巢旁等量脂肪。術(shù)后1周起OVX+MF組按100 mg/(kg·d)灌胃MF，OVX+E2組按0.1 mg/(kg·d)灌胃17-β雌二醇，其它各組灌胃等量蒸餾水,按體重變化調(diào)整藥量，連續(xù)給藥60 d后通過引頸法處死大鼠。分離各組大鼠脛骨,用雙能X線骨密度儀(DEXA，prodigy型，美國GE LUNAR公司)測定右側(cè)脛骨骨密度和骨礦含量。

1.2.2大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)：無菌條件下分離4組大鼠雙側(cè)股骨和脛骨，在含有抗生素的α-MEM溶液中浸泡10 min后沖洗骨髓腔，800 r/min離心細(xì)胞懸液，5 min后用普通培養(yǎng)液重新接種。接種后第3天，用PBS(pH 7.2～7.4)緩慢沖洗掉未貼壁的細(xì)胞，培養(yǎng)基每周更換2次,細(xì)胞基本鋪滿瓶底時，用0.25 %胰酶消化，以1∶2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取生長較好的第3、4代細(xì)胞行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3誘導(dǎo)各組大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化：各組大鼠傳代細(xì)胞以5.0×104個/孔密度接種于24孔板，用基礎(chǔ)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)15～21 d后，收集細(xì)胞行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4細(xì)胞增殖功能測定和細(xì)胞熒光染色：將各組細(xì)胞以1.0×104個/孔密度接種在96孔板，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)6 d后，用MTT法測定細(xì)胞活性及增殖能力；培養(yǎng)結(jié)束后用PBS沖洗細(xì)胞，室溫下用鈣黃綠色素AM熒光探針培養(yǎng)細(xì)胞10 min。

1.2.5堿性磷酸酶活性測定：將各組細(xì)胞以5×105個/孔密度接種于6孔板，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)7 d，用PBS清洗細(xì)胞層，溶解于0.5 mL的0.1 % Triton X-100中，使用Bradford法測定細(xì)胞提取物蛋白含量。

1.2.6礦化結(jié)節(jié)形成和鈣含量的測定：將各組細(xì)胞以5×105個/孔密度接種于6孔板，培養(yǎng)28 d后，PBS洗兩次并用95 %乙醇原位固定，1 %茜素紅染色，鏡下計數(shù)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)目。鈣含量測定方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.2.7RNA提取以及Real-time PCR測定：將各組細(xì)胞以5×105個/孔密度接種于6孔板，成骨誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d后，熒光定量實(shí)時PCR測定成骨細(xì)胞表面基因: collagen type I、OC、OPG、RANKL、IL-6, GAPDH 作為看家基因(引物序列見表1)。反應(yīng)結(jié)束后用雙CT法進(jìn)行PCR相對定量計算。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對去卵巢大鼠骨密度和骨礦含量的影響

與SHAM組比較，OVX組的骨密度和骨礦含量顯著降低，OVX+MF組與OVX+E2組的骨礦含量低于SHAM組(P均<0.05)，而骨密度與SHAM組無顯著差異(P>0.05);OVX+MF組與OVX+E2組的骨密度和骨礦含量均顯著高于OVX組，且OVX+E2組高于OVX+MF組(P<0.05)。見圖1。

表1 引物序列Table 1 Primers Sequence

圖1 各組大鼠骨密度和骨礦含量注：與SHAM組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05；與OVX+E2組比較，▲P<0.05。Fig.1 Bone mineral density and bone mineral content of rats in each group

2.2 大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

倒置相差顯微鏡下，大鼠BMSCs經(jīng)差速貼壁后于2～3 h內(nèi)貼附于培養(yǎng)瓶底(圖2 A)，接種3 d后細(xì)胞呈現(xiàn)不同形態(tài)并向外伸展出生長突，部分細(xì)胞借突起相互連接(圖2B)；隨后生長突相互連接融合成片(圖2C)，成骨細(xì)胞持續(xù)重疊生長，10～12 d后出現(xiàn)散在的致密團(tuán)塊，中央?yún)^(qū)域逐漸變暗，透光不佳，最終形成結(jié)節(jié)(圖2D)。

圖2 大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞的形態(tài)(×100) A:細(xì)胞培養(yǎng)后1 d；B:細(xì)胞接種后3 d；C:細(xì)胞接種后5 d；D:細(xì)胞接種后12 d。Fig.2 Morphological differentiation of rat BMSCs into osteoblasts (×100) A:1 day after cell culture; B:3 days after cell inoculation; C:5 days after cell inoculation; D:12 days after cell inoculation.

2.3 大鼠BMSCs在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長曲線

接種后1～3 d內(nèi)，傳代大鼠BMSCs細(xì)胞增殖緩慢，隨后細(xì)胞增殖速度逐漸增快，第6天達(dá)到頂峰，此后逐漸減慢(圖3)。

圖3 大鼠BMSCs的生長曲線Fig.3 The growth curve of rats BMSCs

2.4 大鼠BMSCs誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后礦化結(jié)節(jié)的形成

在礦化誘導(dǎo)液的培養(yǎng)下，大鼠BMSCs分化為成骨細(xì)胞并呈重疊生長，逐漸形成大小不一的結(jié)節(jié)，隨著膠原沉積和基質(zhì)礦化，最終形成密度不均透光性差的礦化結(jié)節(jié)(圖4)。

圖4 礦化結(jié)節(jié)形成的鑒定 A:骨細(xì)胞鈣化中(誘導(dǎo)后14 d)；B:骨細(xì)胞鈣化形成(誘導(dǎo)后28 d)。Fig.4 Identification of mineralized nodule formation A: osteoblasts are calcifying (14 days after induction); B: osteocyte calcification is formed (28 days after induction).

2.5 各組大鼠BMSCs分化為成骨細(xì)胞后細(xì)胞增殖能力、ALP活性與鈣沉積量的變化

與SHAM組比較，OVX組成骨細(xì)胞增殖能力、ALP活性明顯被抑制，鈣沉積量明顯減少(P<0.05)；與OVX組比較，在給予MF和雌二醇干預(yù)后顯著增強(qiáng)了大鼠成骨細(xì)胞增殖能力和ALP活性，鈣沉積量顯著增加(P<0.05)；且OVX+E2組成骨細(xì)胞增殖能力、ALP活性、鈣沉積量高于OVX+MF組(P<0.05)。見圖5。

圖5 大鼠成骨細(xì)胞的增殖能力、ALP活性及鈣沉積量的變化注：與SHAM組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05；與OVX+E2組比較，▲P<0.05。Fig.5 Changes in cell proliferation, ALP activity and calcium deposition in osteoblasts of rats

2.6 各組大鼠BMSCs的形態(tài)變化

細(xì)胞培養(yǎng)3 d后各組均呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞的典型形態(tài)：多邊形、三角形和梭形(綠色細(xì)胞)。在圖6B(OVX組)中可看到明顯增多的呈現(xiàn)紅色熒光的死亡細(xì)胞，而在圖6 A(SHAM組)中幾乎看不到死亡細(xì)胞；與圖6B(OVX組)比較，圖6C(OVX+E2組)與圖6D (OVX+MF組)中死亡細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞呈現(xiàn)融合趨勢。

圖6 熒光染色大鼠的BMSCs A:SHAM組;B:OVX組;C:OVX+E2組;D:OVX+MF組。Fig.6 Fluorescent staining of BMSCs A: SHAM group; B: OVX group; C: OVX+E2 group; D: OVX+MF group.

圖7 鏡下成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成 A:SHAM組;B:OVX組;C:OVX+E2組;D:OVX+MF組。Fig.7 The formation of mineralized osteoblasts nodules under the microscope A: SHAM group; B: OVX group; C: OVX+E2 group; D: OVX+MF group.

2.7 各組大鼠成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)的形成

在礦化誘導(dǎo)液培養(yǎng)21 d后，鏡下觀察，圖7 A(SHAM組)成骨細(xì)胞多層重疊生長并隨著膠原和鈣鹽沉積，形成數(shù)量較多的礦化結(jié)節(jié)；而在圖7B(OVX組)成骨細(xì)胞鈣化明顯受到抑制，細(xì)胞沒有顯著融合，未見顯著的礦化結(jié)節(jié)；但在圖7C(OVX+E2組)與圖7D(OVX+MF組)中，成骨細(xì)胞重疊生長逐漸形成礦化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)數(shù)量較多，周圍有較多鈣鹽沉積。

2.8 各組大鼠成骨細(xì)胞的基因表達(dá)變化

與SHAM組比較，OVX組中collagen type I、OC、OPG mRNA表達(dá)水平顯著降低，RANKL、IL-6 mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，而OVX+MF組collagen type I、OC、OPG、RANKL、IL-6mRNA的表達(dá)水平均高于SHAM組(P<0.05)；與OVX組相比，OVX+E2組、OVX+MF組明顯增加了collagen type I、OC、OPG mRNA的表達(dá)水平，并抑制了RANKL，IL-6mRNA的表達(dá)(P<0.05)；與OVX+E2組比較，OVX+MF組collagen type I、OC、OPG mRNA表達(dá)水平低于OVX+E2組，且RANKL、IL-6mRNA的表達(dá)高于OVX+E2組(P<0.05)。見圖8。

圖8 各組大鼠成骨細(xì)胞的基因表達(dá)注：與SHAM組比較，*P<0.05；與OVX組比較，#P<0.05；與OVX+E2組比較，▲P<0.05。Fig.8 Gene expression of osteoblasts in each group

3 討論

MF是2型糖尿病患者的首選用藥，可通過多種機(jī)制影響骨代謝：一方面通過AMPK-mTORC2和AKT-mTORC1信號軸調(diào)節(jié)SIRT6和OCT4的表達(dá)，促進(jìn)成骨前細(xì)胞的增殖和分化[5]；另一方面通過AMPK/Runx2/Cbfa1通路誘使大鼠脛骨BMSCs向成骨細(xì)胞分化，刺激礦化結(jié)節(jié)的形成[6]；此外還能減少晚期糖基化終末產(chǎn)物的產(chǎn)生，逆轉(zhuǎn)和改善高糖對成骨細(xì)胞功能的損傷[7]。臨床研究[8]發(fā)現(xiàn)MF可降低糖尿病患者骨折發(fā)生風(fēng)險，本研究以去卵巢大鼠模擬骨質(zhì)疏松癥，以雌二醇為對照進(jìn)一步探究MF抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。

OPG/RANKL/RANK通路是影響骨代謝最主要的途徑[9]。骨吸收因子刺激成骨細(xì)胞膜表達(dá)RANKL分子，后者與破骨細(xì)胞膜上的RANK結(jié)合后，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞膜上腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子與RANK的胞內(nèi)區(qū)結(jié)合并激活下游多種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路，上調(diào)促骨吸收因子的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟，增強(qiáng)骨吸收活性[10]。而由成骨細(xì)胞生成的OPG可競爭性與RANKL結(jié)合，阻止這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，負(fù)性調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的生成[11]。雌激素缺乏會使OPG/RANKL比例失調(diào)，破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，誘使發(fā)生骨質(zhì)疏松[12]。本研究中，去卵巢大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞的分化受到抑制，collagen type I、OC、OPG mRNA表達(dá)明顯受到抑制，而RANKL、IL-6 mRNA表達(dá)水平明顯增加，給予雌二醇干預(yù)后，去卵巢大鼠的collagen type I、OC、OPG mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，而RANKL、IL-6mRNA表達(dá)明顯減弱，由此導(dǎo)致其骨密度以及骨礦含量也顯著增加，雌二醇顯著逆轉(zhuǎn)了去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松；用MF干預(yù)去卵巢大鼠BMSCs后，collagen type I、OC、OPG mRNA表達(dá)顯著增強(qiáng)，RANKL、IL-6 mRNA表達(dá)明顯減弱，且MF對collagen type I、OC、OPG mRNA的表達(dá)表現(xiàn)出強(qiáng)于正常對照組的特性，提示MF通過OPG/RANKL/RANK通路增加成骨細(xì)胞活性，抑制破骨細(xì)胞分化，發(fā)揮骨保護(hù)作用，尤其在增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性方面有優(yōu)勢。體外培養(yǎng)SD大鼠的BMSCs并給予100 μmol/L MF孵育21 d后發(fā)現(xiàn)，BMSCs中促成骨基因表達(dá)增加而促成脂基因表達(dá)減少,且MF顯著促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的沉積，阻斷胞質(zhì)脂滴的形成，提示MF可誘使BMSCs成骨分化而抑制其脂向分化[13]。在本研究中亦發(fā)現(xiàn)MF可進(jìn)一步誘導(dǎo)去卵巢大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞分化，顯著增強(qiáng)ALP活性和成骨細(xì)胞的鈣化能力，并增加其骨密度和骨礦含量，雖然MF的作用弱于雌二醇，但仍能有效改善去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松的狀態(tài)。

本研究的不足之處在于未進(jìn)行MF不同劑量的對比，不能排除劑量對研究結(jié)果的影響；此外，MF對骨代謝影響可能與動物的種系、年齡、體重以及體內(nèi)激素水平和炎癥狀態(tài)等有關(guān)，因此仍需要大量的基礎(chǔ)和臨床研究進(jìn)一步證實(shí)MF對骨代謝的影響。

總之，本研究結(jié)果表明，MF不僅增加了去卵巢大鼠的骨密度和骨礦物含量，增強(qiáng)了成骨細(xì)胞增殖和鈣化能力以及ALP活性，還可經(jīng)由OPG/RANKL/RANK途徑誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，阻礙破骨細(xì)胞的成熟。盡管MF的抗骨質(zhì)疏松作用遜于雌二醇，但其在促進(jìn)成骨細(xì)胞基因表達(dá)活性方面有優(yōu)勢，MF潛在的骨保護(hù)作用可能會改善糖尿病所引起的骨質(zhì)疏松癥。