李晶峰 李春楠 楊小倩 郅慧 王亞平 張輝 孫佳明

長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種常見疾病，其特征是骨密度(bone mineral density，BMD)普遍降低，骨組織微結(jié)構(gòu)惡化，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。龜甲是中醫(yī)臨床常用的抗骨質(zhì)疏松藥物，具有滋養(yǎng)腎陰之功效，可生髓益腎強(qiáng)骨，固經(jīng)止血，補(bǔ)心安神。龜甲對糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松大鼠腰椎、脛骨骨密度和骨強(qiáng)度均有改善作用[1]，龜甲能夠使糖尿病性骨質(zhì)疏松患者骨密度顯著上升[2]，但對于龜甲治療骨質(zhì)疏松的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與機(jī)制報(bào)道卻很少。因此，分析龜甲的活性成分、作用靶點(diǎn)及其可能作用的機(jī)制有利于闡述龜甲的科學(xué)內(nèi)涵，并促進(jìn)其臨床應(yīng)用。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過構(gòu)建“疾病-基因-靶點(diǎn)-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，揭示多種化合物協(xié)同作用于人體的機(jī)制。中藥及其復(fù)方藥味較多，化學(xué)成分復(fù)雜，往往具有藥效分散、靶向眾多的特點(diǎn)。而正是由于多靶向作用原理，彌補(bǔ)了中藥復(fù)方針對單靶點(diǎn)藥效不強(qiáng)的缺陷，表現(xiàn)出整體治療、協(xié)同調(diào)理并舉的特色，體現(xiàn)了中藥“物質(zhì)基礎(chǔ)-藥性-藥效”的關(guān)系特點(diǎn)[3]。

本研究通過對龜甲成分與骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)進(jìn)行對比，篩選龜甲中治療骨質(zhì)疏松有效成分及相關(guān)靶點(diǎn)，通過KEGG通路分析，合理推斷龜甲治療骨質(zhì)疏松作用機(jī)制，為龜甲的現(xiàn)代藥理學(xué)研究提供參考，也為其他中藥的相關(guān)研究提供借鑒。

1 數(shù)據(jù)庫

BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫、 TTD數(shù)據(jù)庫、DrugBank數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、KEGG數(shù)據(jù)庫。

2 方法

2.1 龜甲化學(xué)成分的收集

本研究綜合BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)調(diào)研，構(gòu)建了龜甲化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫。經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢與文獻(xiàn)檢索共得到40個(gè)化合物[4-7]。

2.2 龜甲化學(xué)成分靶點(diǎn)的獲得

龜甲化學(xué)成分靶點(diǎn)從BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得，數(shù)據(jù)庫沒有靶點(diǎn)的化學(xué)成分，利用SwissTarget Prediction，得到化合物靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)通過Uniprot網(wǎng)站標(biāo)準(zhǔn)化為Uniprot ID。

2.3 骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)的獲得

在TTD數(shù)據(jù)庫、Drugbank 數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫中輸入“Osteoporosis”，得到骨質(zhì)疏松疾病的靶點(diǎn)，靶點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)化為Uniprot ID。

2.4 通路富集分析

基因本體論(gene ontology，GO)是用于描述基因產(chǎn)物功能并廣泛應(yīng)用的一個(gè)本體，它能夠在基因組規(guī)模下和不同物種之間對給定基因集進(jìn)行功能注釋。京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，用于從分子水平信息了解細(xì)胞、生物體和生態(tài)系統(tǒng)等生物系統(tǒng)。本研究采用在線分析工具M(jìn)etascape，對龜甲活性化學(xué)成分靶基因KEGG富集分析、龜甲治療骨質(zhì)疏松靶基因進(jìn)行GO、KEGG富集分析[8]。

3 結(jié)果

3.1 龜甲活性成分

數(shù)據(jù)庫與文獻(xiàn)共收集龜甲活性成分40個(gè)，其中包括氨基酸、脂肪酸、酯類、甾醇類、其他類，見表1。

表1 龜甲活性成分的主要信息

3.2 龜甲活性成分靶基因KEGG通路富集分析

龜甲成分通過數(shù)據(jù)庫共收集530個(gè)靶基因，利用Metascape對龜甲活性成分靶基因進(jìn)行KEGG富集分析。P值排名前20的KEGG代謝通路在圖1 A中表示，聚類網(wǎng)絡(luò)樹見圖1B。

圖1 龜甲活性成分靶基因KEGG富集分析圖 A：富集項(xiàng)熱圖；B：富集項(xiàng)網(wǎng)絡(luò)圖。Fig.1 KEGG enrichment of active components in tortoise shell A: Heat map of enriched; B: Network of enriched termsterms.

龜甲活性化合物關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG富集分析如表2所示，這些基因主要與神經(jīng)活性配體-受體相互作用、氨酰- tRNA生物合成、谷氨酸能突觸等信號(hào)通路相關(guān)。

3.3 龜甲治療骨質(zhì)疏松靶基因功能與通路富集分析

3.3.1龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因?qū)?yīng)化合物分析：龜甲成分篩選出530個(gè)靶基因，骨質(zhì)疏松篩選出84個(gè)靶基因，骨質(zhì)疏松與龜甲成分交集共15個(gè)基因：UGT2B17、PTGS2、SLC22A6、SLC22A10、PTGER2、SRC、COMT、TNF、ESR1、CYP19A1、ESR2、AR、PGR、ITGB3、FDPS。這些靶點(diǎn)對應(yīng)的化合物有脂肪酸類6個(gè)、氨基酸類4個(gè)、甾醇類5個(gè)、其他類2個(gè)，見表3。

3.3.2龜甲抗骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)-功能相關(guān)蛋白網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)分析：分析蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮匦?，不僅有助于研究未知蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，也為進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)之間如何通過相互作用來完成生命活動(dòng)提供理論依據(jù)。蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)自由度越大則表明其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)；平均最短路徑長度越小說明蛋白越重要。節(jié)點(diǎn)距離其他節(jié)點(diǎn)越近，則接近中心性越大[9]。應(yīng)用Network Analyzer得到15個(gè)靶點(diǎn)的相關(guān)拓?fù)鋽?shù)據(jù)，排名前7位的PTGER2(EP2)，ITGB3，PGR，SRC，F(xiàn)DPS，COMT，TNF為龜甲治療骨質(zhì)疏松的關(guān)鍵靶點(diǎn)，如表4所示為關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)拓?fù)鋮?shù)。前列腺素(prostaglandins，PG)在調(diào)節(jié)骨對機(jī)械刺激反應(yīng)中起重要作用。前列腺素E2(PGE2)是骨代謝的有效調(diào)節(jié)因子。PGE2對骨的影響是通過四種受體(EP1、EP2、EP3和EP4)介導(dǎo)的。EP2受體對小鼠骨骼生物力學(xué)性能的影響較大，EP2受體缺失導(dǎo)致小鼠骨生物力學(xué)強(qiáng)度降低[10]。破骨細(xì)胞的激活會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞特異基因ITGB3的表達(dá)[11]。 SCR在骨代謝中發(fā)揮重要作用，SCR家族酪氨酸激酶參與礦物形成[12]；血小板衍生生長因子BB在人成骨細(xì)胞分化和增殖中起著重要作用，血小板衍生生長因子BB還上調(diào)成骨相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)礦物質(zhì)結(jié)節(jié)的形成，SCR參與這些過程[13]。兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol-o-methyltransferase，COMT)多態(tài)性可以改變骨微環(huán)境和/或循環(huán)中的雌激素狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)身體活動(dòng)與骨參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)[14]。法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)DPS)與氨基雙膦酸鹽治療后的骨密度和骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的變化有關(guān)[15-16]。骨代謝涉及骨保護(hù)素(OPG)及其配體在內(nèi)的腫瘤壞死因子(TNF)受體家族，OPG是TNF受體超家族的細(xì)胞因子，TNF-α和Il-1β可升高OPG水平[17]。

表2 龜甲活性成分靶基因KEGG富集分析Table 2 KEGG enrichment of active components in tortoise shell

表3 龜甲抗骨質(zhì)疏松15個(gè)靶點(diǎn)對應(yīng)的化合物

圖2 龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因的GO富集分析 A：GO富集項(xiàng)熱圖；B：GO富集項(xiàng)網(wǎng)絡(luò)圖。Fig.2 GO enrichment of the target gene of tortoise shell anti osteoporosis A: Heat map of enriched terms across input gene lists; B: Network of GO enriched terms.

3.3.3龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因GO通路富集分析：龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因共15個(gè)，基于Metascape平臺(tái)進(jìn)行GO富集分析，GO富集項(xiàng)見圖2。龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因GO富集分析見表5，主要與對類固醇激素的反應(yīng)、上皮細(xì)胞增殖的調(diào)控、脂質(zhì)定位的調(diào)節(jié)等相關(guān)。類固醇激素是一類具有神經(jīng)活性的甾體激素，由腎上腺皮質(zhì)分泌，臨床應(yīng)用廣泛，但長期使用會(huì)產(chǎn)生骨質(zhì)疏松癥[18]；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者血清高密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇水平較高[19]；糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松是一種藥物性繼發(fā)性骨質(zhì)疏松，主要由骨形成抑制引起，與成骨細(xì)胞的增殖和功能密切相關(guān)[20]。

表4 龜甲治療骨質(zhì)疏松靶基因的拓?fù)鋮?shù)

3.3.4龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因KEGG通路富集分析：利用Metascape在線工具對龜甲抗骨質(zhì)疏松15個(gè)靶基因進(jìn)行KEGG富集分析，P值排名前3的KEGG代謝通路見圖3。結(jié)果表明,這些基因主要與類固醇激素生物合成、甲狀腺素信號(hào)途徑、癌癥的途徑信號(hào)通路相關(guān)，分析見表6。雌激素是一種類固醇激素，雌激素水平的降低可導(dǎo)致骨質(zhì)疏松[21]。 Xia T[22]的研究表明熟地黃提取物主要通過干預(yù)類固醇激素的生物合成來預(yù)防糖皮質(zhì)激素引起的骨質(zhì)疏松。Arnautovic-Halimic A[23]評(píng)價(jià)絕經(jīng)后正常甲狀腺婦女骨質(zhì)丟失早期和晚期甲狀腺素水平及骨密度比值，患有骨質(zhì)疏松癥的患者組和保留骨量的患者組的促甲狀腺素(thyroid-stimulating hormone，TSH)和游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine，F(xiàn)T3)的平均水平?jīng)]有顯著差異，而患有骨質(zhì)疏松癥的血清婦女的游離甲狀腺素(free thyroxine，F(xiàn)T4)的平均水平與對照組相比在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著降低，甲狀腺素(TSH)狀態(tài)的生理變化可能是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的早期指標(biāo)。Kim等[24]證明在健康的甲狀腺功能正常的婦女中，TSH值與低礦物質(zhì)骨密度有關(guān)。在某些絕經(jīng)后婦女中，骨質(zhì)疏松癥已被認(rèn)為是雌激素受體陽性乳腺癌治療的晚期效應(yīng)[25]。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)家族的一員，RANKL上調(diào)時(shí)會(huì)促進(jìn)破骨細(xì)胞分化，并導(dǎo)致過度的骨吸收，從而導(dǎo)致骨完整性喪失[26]。RANKL同時(shí)參與了乳腺腫瘤的發(fā)生，在RANK和RANKL受體缺陷小鼠的研究中，哺乳期的乳腺?zèng)]有發(fā)展為癌癥[27]。在另一項(xiàng)研究[28]中，小鼠乳腺癌變的發(fā)展與RANKL表達(dá)增加有關(guān)，并且加速RANK轉(zhuǎn)基因小鼠乳腺癌變。前列腺癌患者因癌癥治療會(huì)引起骨質(zhì)流失并存在骨折的危險(xiǎn)，并面臨著病理性骨折、嚴(yán)重骨痛和其他骨轉(zhuǎn)移后遺癥的風(fēng)險(xiǎn)[29]。

圖3 龜甲抗骨質(zhì)疏松靶基因的KEGG富集分析Fig.3 Key target pathway enrichment analysis of tortoise shell for osteoporosis

表5 龜甲治療骨質(zhì)疏松靶基因GO功能富集分析Table 5 GO network enrichment analysis of key network targets of tortoise shell for osteoporosis

表6 龜甲治療骨質(zhì)疏松靶基因KEGG富集分析Table 6 Key target pathway enrichment analysis of tortoise shell for osteoporosis

3.3.5龜甲-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖:利用Cytoscape軟件建立了龜甲11種活性化合物、15個(gè)靶基因與3條通路之間的龜甲-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。

圖4 龜甲-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖注：代表龜甲，代表成分，代表靶點(diǎn)，代表通路。Fig.4 network of tortoise shell-component-target-pathway

4 討論

OP是一種骨代謝疾病，臨床表現(xiàn)主要為骨結(jié)構(gòu)異常、骨脆性增高和骨量減少，易出現(xiàn)骨折，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[30]。龜甲具有滋陰潛陽、益腎強(qiáng)骨之功效，可促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向分化[31]，并對骨質(zhì)疏松有較好的治療效果[32]，符合“腎主骨，生髓”的中醫(yī)基礎(chǔ)理論，可作為補(bǔ)腎類治療OP的中藥。

龜甲中主要含有氨基酸、脂肪酸等成分，Su Y等[33]分析的1 424名男性和1 573名女性(平均年齡72歲)中，血清纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和色氨酸濃度與髖部骨密度有關(guān)，血清總同型半胱氨酸濃度與骨密度相關(guān)，較高的血清色氨酸濃度有可能降低發(fā)生骨質(zhì)疏松性骨折的風(fēng)險(xiǎn)，男性血清中同型半胱氨酸的含量與骨質(zhì)疏松性骨折相關(guān)；骨骼攝取的脂肪酸很可能被加工以生成ATP，因?yàn)轶w內(nèi)骨從頭合成脂質(zhì)的測量值較低，血清脂蛋白對正常成骨細(xì)胞增殖是必需的[34]，成骨細(xì)胞可以氧化脂肪酸，脂肪酸氧化產(chǎn)生的能量能夠促進(jìn)骨形成[35]，隨著成骨細(xì)胞體外成熟，脂肪酸氧化顯著增加[36]；碳酸鈣能提高骨質(zhì)疏松大鼠的抗氧化能力，增加骨密度，提高血清鈣水平，減少骨礦流失，從而防治骨質(zhì)疏松癥[37]。

將宏觀藥效與微觀藥物分子機(jī)制有機(jī)結(jié)合，在中醫(yī)理論要求的整體層面上對龜甲單味藥與機(jī)體的交互作用進(jìn)行分析，同時(shí)聯(lián)系現(xiàn)代醫(yī)學(xué)“基因-疾病-藥物”研究模式進(jìn)行新的藥物靶點(diǎn)、作用通路預(yù)測極具意義。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步探討了龜甲活性成分、相關(guān)靶點(diǎn)、龜甲治療骨質(zhì)疏松靶點(diǎn)及其相關(guān)通路，構(gòu)建了龜甲-成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖。預(yù)測了龜甲治療骨質(zhì)疏松的相應(yīng)靶點(diǎn)及通路，涉及類固醇激素、甲狀腺素、癌癥等多個(gè)環(huán)節(jié)，各通路間通過共有靶點(diǎn)連接，闡明龜甲不同成分間的多靶點(diǎn)、多途徑的協(xié)同作用。