石曉花，董 玥，付 超，徐 磊，袁 罡，莽 靖，王姣琦*，徐忠信*

(1.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春130033)

激活素A(Activin A，ActA)是目前較為公認(rèn)的神經(jīng)保護(hù)因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)外缺血性腦損傷中，ActA主要通過下游Smads信號(hào)通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)、抗氧化應(yīng)激和自噬調(diào)控等作用[2,3]。課題組近期研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦損傷后ActA/Smads信號(hào)僅短時(shí)活化，隨后在Smad錨捉蛋白(Smad anchor for receptor activation，SARA)的調(diào)控下出現(xiàn)自發(fā)衰減[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-17(miR-17)可通過調(diào)控SARA的表達(dá)阻斷食管鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲[6]。在腦缺血損傷過程中，miR-17是否通過SARA調(diào)控ActA/Smads信號(hào)尚不清楚。為探討該問題，本研究通過miR-17 mimic轉(zhuǎn)染及雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，初步探討了miR-17在體外腦缺血損傷過程中對(duì)SARA的調(diào)控作用，為延長(zhǎng)ActA/Smads信號(hào)活化時(shí)程，提高ActA神經(jīng)保護(hù)作用提供潛在干預(yù)位點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大鼠高分化腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤(PC12 細(xì)胞)購(gòu)自上海生物科學(xué)院細(xì)胞資源中心。miRNA qRT-PCR試劑盒、riboFECTTM CP Reagent轉(zhuǎn)染試劑、雙熒光素酶報(bào)告基因載體、mimic及陰性對(duì)照NC購(gòu)自廣州銳博公司。兔抗大鼠SARA抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics公司；二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)及OGD模型的復(fù)制 高分化PC12細(xì)胞在10 %胎牛血清的高糖DMEM中培養(yǎng)，在37℃，5 % CO2的潮濕培養(yǎng)箱中孵育。利用含連二亞硫酸鈉(NaS2O4，終濃度1 mM)的無糖DMEM培養(yǎng)液在37℃，5% CO2、95% N2的培養(yǎng)箱中氧糖剝奪(Oxygen Glucose Deprivation，OGD)處理細(xì)胞[5]。OGD計(jì)時(shí)0、1.5、3、6、12 h。

1.2.2miR-17的表達(dá)檢測(cè) 為檢測(cè)miR-17在體外氧糖剝奪模型中的表達(dá)變化，本研究收集OGD不同處理時(shí)長(zhǎng)的高分化PC12細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，使用miR-qRT-PCR試劑盒，按照說明書步驟進(jìn)行加尾、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，以U6為內(nèi)參對(duì)照?；蛞锶缦拢簃iR-17逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCG GCAATTCAGTTGAGCTACCTGC-3′，上游引物：5′-ACACTCCAGCTGGGC AAAGTGCTTACAGTGC-3′，下游引物：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6 逆轉(zhuǎn)錄引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，上游引物：5′-CTCGC TTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。應(yīng)用ABI7500Fast 型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行熒光收集及分析。PCR運(yùn)行參數(shù)：95℃預(yù)變性20 s，然后95℃變性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用Relative Quantification (ddCt) Study進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量(relative quantity，RQ)RQ分析，計(jì)算SARA基因的相對(duì)表達(dá)水平。檢測(cè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3miR-17 mimic轉(zhuǎn)染 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的高分化PC12細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞密度達(dá)70-80%。次日更換6孔板內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)液為無血清的高糖DMEM，按照說明書步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染mimic的終濃度為50 nM。轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)液更換為含血清的完全培養(yǎng)液。在轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h分別收集細(xì)胞，每組3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4Western blot蛋白水平表達(dá)檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染不同時(shí)間分組的細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整上樣量。按照操作步驟進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉，使用含5 %脫脂奶粉的TBST溶液稀釋一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜后洗膜，二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，洗膜后ECL顯影壓膠片。凝膠圖像分析，掃描膠片，吸光度分析，計(jì)算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參條帶的灰度值，使用兩者的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) SARA又稱Zfyve9。利用MiRDB(http://mirdb.org/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)在線分析軟件，預(yù)測(cè)miR-17對(duì)SARA 3’ UTR區(qū)的潛在調(diào)控位點(diǎn)：GCACTTTA(57-64)和GCACTTT(403-409)。將SARA 3’ UTR區(qū)克隆至pmiR-RB-REPORTTM雙熒光素酶報(bào)告載體。根據(jù)兩個(gè)預(yù)測(cè)位點(diǎn)，委托廣州銳博公司設(shè)計(jì)并合成野生型及突變型報(bào)告載體，分別為：R-Zfyve9-WT1(野生型)、R-Zfyve9-MUT1(57-64位突變，CGTGAAAT)、R-Zfyve9-MUT2(403-409位突變，CGTGAAA)和R-Zfyve9-MUT3(57-64位突變，CGTGAAAT和403-409位突變，CGTGAAA)。所有載體的報(bào)告熒光為位于目的基因3’ UTR區(qū)上游的海腎熒光素酶基因(hRluc)，校正熒光為螢光蟲熒光素酶基因(hluc)。將miR-17 mimic(終濃度50 nM)與報(bào)告基因載體(250 ng/孔)使用LipofectamineTM2000共轉(zhuǎn)染接種于96孔板的293T細(xì)胞，每組3復(fù)孔。轉(zhuǎn)染6 h后更換新鮮培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h后吸出培養(yǎng)基，加入luciferase底物，振蕩10 min后加入Stop reagent，振蕩后熒光照度計(jì)測(cè)定熒光值。通過報(bào)告基因相對(duì)熒光值的下調(diào)來印證miRNA與靶基因的相互作用。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-17在體外缺血損傷中的動(dòng)態(tài)變化

利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)miR-17的表達(dá)情況。結(jié)果miR-17在OGD早期1.5 h即可檢測(cè)到表達(dá)上調(diào)，至OGD 3 h時(shí)達(dá)到高峰，超過OGD 0 h組10倍(P<0.05，如圖1)。隨著OGD時(shí)間延長(zhǎng)，miR-17表達(dá)顯著降低，到OGD 6 h和12 h時(shí)表達(dá)量與OGD 0 h比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 miR-17表達(dá)隨OGD動(dòng)態(tài)變化a與OGD 0 h組比較P<0.05，b與OGD 1.5 h組比較P<0.05，c與OGD 3 h組比較P<0.05，n≥3/組

2.2 miR-17下調(diào)SARA蛋白表達(dá)

為明確miR-17對(duì)SARA的表達(dá)調(diào)控作用，本研究利用miR-17 mimic轉(zhuǎn)染高分化PC12細(xì)胞，并使用Western blot技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)染不同時(shí)間的SARA蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果，不同轉(zhuǎn)染時(shí)間的mimic NC組SARA蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組(control)相比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-17 mimic轉(zhuǎn)染抑制SARA蛋白表達(dá)，轉(zhuǎn)染24 h組SARA蛋白水平下調(diào)了57.01%。隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-17 mimic轉(zhuǎn)染組SARA蛋白水平雖略有回升，但miR-17 mimic仍能有效抑制SARA蛋白表達(dá)直至mimic轉(zhuǎn)染72 h(P<0.05，如圖2)。

圖2 miR-17 mimic抑制SARA蛋白表達(dá)(A)SARA蛋白表達(dá)檢測(cè)；(B)SARA蛋白表達(dá)的灰度分析(a與對(duì)照組比較P<0.05，b與相應(yīng)轉(zhuǎn)染時(shí)間的mimic NC組比較P<0.05，n≥3/組)

2.3 miR-17靶向調(diào)控SARA表達(dá)

R-Zfyve9-WT1、R-Zfyve9-MUT1、R-Zfyve9-MUT2和R-Zfyve9-MUT3 4種雙熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-17 mimic或 NC轉(zhuǎn)染后熒光分析示： 與R-Zfyve9-WT1+NC組比較，R-Zfyve9-WT1+miR-17 mimic組報(bào)告熒光顯著下調(diào)，說明miR-17對(duì)SARA基因的3’UTR 區(qū)存在靶向調(diào)控。對(duì)兩個(gè)預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)進(jìn)行突變后發(fā)現(xiàn)，突變型載體Mut1、Mut2、Mut3與miR-17 mimic共轉(zhuǎn)染熒光強(qiáng)度較R-Zfyve9-WT1+miR-17 mimic組明顯恢復(fù)(P<0.05，如圖3)。說明位點(diǎn)(57-64)和位點(diǎn)(403-409)是miR-17調(diào)控SARA表達(dá)的靶點(diǎn)，且位點(diǎn)(57-64)和位點(diǎn)(403-409)的調(diào)控功能上呈現(xiàn)一定的協(xié)同作用。

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)鑒定miR-17作用靶點(diǎn)a與R-Zfyve9-WT1+NC組比較P<0.05，b與R-Zfyve-WT1+rno-miR-17-5p組比較P<0.05，c與R-Zfyve-Mut1+rno-miR-17-5p組比較P<0.05，d與R-Zfyve-Mut2+rno-miR-17-5p組比較P<0.05

3 討論

激活素A (ActA)，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族的成員之一。通過ActA/Smads跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，ActA在缺血性腦損傷、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病以及神經(jīng)精神類疾病中均發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，與經(jīng)典的ActA/Smads線性通路不同，ActA/Smads信號(hào)具有正反饋環(huán)路作用模式：環(huán)路活化呈細(xì)胞外ActA濃度梯度依賴，信號(hào)活化后可反過來上調(diào)ActA基因的表達(dá)[4]。這樣在外界刺激誘導(dǎo)ActA基因表達(dá)上調(diào)后，ActA信號(hào)可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)跨膜信號(hào)的級(jí)聯(lián)放大和活化，繼而在SARA的輔助下通過膜受體激活Smads(R-Smads)的磷酸化活化和核內(nèi)遷移，實(shí)現(xiàn)靶基因的表達(dá)調(diào)控，為ActA在急性腦缺血損傷的早期應(yīng)答奠定生物學(xué)基礎(chǔ)。然而ActA/Smads環(huán)路在短時(shí)程激活后自發(fā)衰減，呈現(xiàn)一定的自限性[4]。盡管ActA在缺血損傷的早期及延時(shí)缺血再灌注過程中均被發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護(hù)作用[7,8]，但是受環(huán)路自限性的影響，內(nèi)源性ActA信號(hào)在缺血性腦卒中早期活化后很快進(jìn)入衰竭階段，將難以持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)功能。因此，闡明ActA環(huán)路自限性及信號(hào)衰減的可能機(jī)制，并以此為切入點(diǎn)，尋找相應(yīng)的干預(yù)靶點(diǎn)，延長(zhǎng)ActA信號(hào)環(huán)路活化時(shí)程，是ActA內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)研究有待解決的關(guān)鍵問題。SARA作為TGF-β/Smads信號(hào)通路的銜接蛋白，是R-Smads向膜受體募集的重要輔助因子，具有調(diào)控R-Smads與膜受體定位，影響R-Smads平衡和分布的作用。在體外腦缺血性損傷模型中，SARA是ActA信號(hào)下游R-Smads磷酸化活化的輔助因子[9]，其表達(dá)下調(diào)是ActA環(huán)路自限性的一個(gè)調(diào)控因素[4]。但引起SARA表達(dá)下調(diào)，ActA信號(hào)環(huán)路衰減的因素尚不清楚。

近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-17可通過調(diào)控SARA的表達(dá)阻斷食管鱗狀細(xì)胞癌的遷移和侵襲[6]。miRNA基因轉(zhuǎn)錄的初級(jí)產(chǎn)物經(jīng)剪切產(chǎn)生雙鏈RNA雙體(microRNA：microRNA*)，即成熟的miRNA和其互補(bǔ)序列所組成的二聚體。成熟的microRNA單鏈會(huì)選擇性地整合入RISC(RNA induced silencing complex)中識(shí)別靶基因，通過mRNA剪切和抑制蛋白質(zhì)翻譯的方式負(fù)性調(diào)控靶基因表達(dá)。microRNA*可能會(huì)被快速降解。大部分成熟microRNA來源于5’末端RNA鏈。本研究中的miR-17也一樣。它在包括腦組織在內(nèi)的多種組織細(xì)胞廣泛表達(dá)。既往研究發(fā)現(xiàn)，miR-17在胚胎發(fā)育、神經(jīng)元分化方面發(fā)揮作用，而且還調(diào)控了TGF-β超家族中骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)及TGF-β的信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)[10-12]。但在ActA介導(dǎo)的抗腦缺血損傷信號(hào)環(huán)路中，miR-17的生物學(xué)功能尚不清楚。TargetScan、miRDB檢測(cè)提示，miR-17與SARA的調(diào)控位點(diǎn)多物種間具有高度保守性。本研究在上述前期工作基礎(chǔ)上，通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-17在體外腦缺血性損傷后表達(dá)上調(diào)，在OGD3 h時(shí)達(dá)到高峰，隨后降低。miR-17的這種表達(dá)變化特點(diǎn)與既往前期研究中發(fā)現(xiàn)的ActA/Smads信號(hào)強(qiáng)度變化規(guī)律相符。進(jìn)一步對(duì)miR-17功能研究發(fā)現(xiàn)，miR-17 mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染可顯著下調(diào)SARA蛋白表達(dá)。說明miR-17可以通過調(diào)控SARA的表達(dá)水平調(diào)控ActA信號(hào)活化強(qiáng)度。進(jìn)一步的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)證實(shí)miR-17能夠通過這(57-64)和(403-409)位點(diǎn)靶向調(diào)控 SARA 表達(dá)，并且在對(duì)位點(diǎn)(57-64)和位點(diǎn)(403-409)的調(diào)控功能上呈現(xiàn)一定的協(xié)同作用。這樣靶向miR-17的干預(yù)可通過上調(diào)SARA表達(dá)來實(shí)現(xiàn)增強(qiáng)ActA信號(hào)的作用，并為明確ActA信號(hào)衰減機(jī)制提供數(shù)據(jù)參考。