王學(xué)菊,王雪梅,楊紹娟,王麗萍

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 病理科,吉林 長春130033)

DNA啟動子或編碼區(qū)CpG島甲基化可通過轉(zhuǎn)錄抑制途徑參與惡性腫瘤的發(fā)生和化療藥的耐藥[1]。胞嘧啶5’位點甲基化(5-methylcytosine，5mc)是惡性腫瘤中常見的DNA甲基化位點[2]。5mc的形成是一個可逆的過程，研究顯示TERT家族蛋白可將5mc進(jìn)一步氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine，5hmc)，從而進(jìn)入胸腺DNA合成途徑[3]。惡性腫瘤，包括淋巴瘤中5hmC表達(dá)缺失預(yù)后差[4-6]，提示監(jiān)測5hmc表達(dá)水平有助于判斷預(yù)后和療效評估。非霍奇金淋巴瘤是最為常見的淋巴瘤類型，尚未有詳細(xì)研究探明其甲基化狀態(tài)[7]。本研究選取非霍奇金淋巴瘤代表性病例通過觀察5hmc表達(dá)情況探討其氧化途徑是否存在抑制現(xiàn)象。

1 材料與方法

1.1 研究資料

實驗中共收集了33例回顧性淋巴瘤病例，高侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤16例，其中彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤13例，F(xiàn)L III級1例，富于T和組織細(xì)胞的大B細(xì)胞淋巴瘤1例，Burkitt淋巴瘤1例，發(fā)病年齡23歲-81歲，男性7例、女性9例；T細(xì)胞淋巴瘤17例，其中非特殊型周圍T細(xì)胞淋巴瘤11例，單形性親上皮型T細(xì)胞淋巴瘤 3例，間變大細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞白血病和NK/T細(xì)胞淋巴瘤各1例,發(fā)病年齡26-71歲，男性11例、女性6例。

1.2 免疫組化及結(jié)果判讀

實驗病例石蠟包埋標(biāo)本用于免疫組化的切片厚度為3 μm。5hmc抗體(兔源性多抗，購自Active motif公司) 1∶1500稀釋。免疫組化流程參照試劑盒說明書。5hmc為細(xì)胞核著色，所有染色切片經(jīng)兩名病理科醫(yī)生判定,評分標(biāo)準(zhǔn)如下：陰性(無著色)，1-50%細(xì)胞陽性，>50%細(xì)胞陽性[8]。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Graphpad Prism 8.3.0對B細(xì)胞淋巴瘤和T細(xì)胞淋巴瘤表達(dá)率進(jìn)行卡方檢驗，P值小于0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

在所有檢測病例中殘存正常淋巴細(xì)胞5hmc在細(xì)胞核強(qiáng)陽性表達(dá)，為實驗提供內(nèi)對照。結(jié)果如表1、圖1所示。和正常淋巴細(xì)胞相比，16例高侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤7例無著色(7/16,43.7%)，8例腫瘤細(xì)胞陽性率低于50%(8/16,50%)，1例陽性細(xì)胞數(shù)大于50%(1/16,6.3%)。17例T細(xì)胞淋巴瘤病例中15例無著色(15/17,88.2%)，1例陽性細(xì)胞數(shù)低于50%(1/17,5.9%)，1例陽性細(xì)胞數(shù)大于50%(1/17,5.9%)。

圖1 非霍奇金淋巴瘤5hmc免疫表型特征代表性病例(×100)。A-C為高侵襲性B細(xì)胞淋巴瘤代表性病例表達(dá)情況。A為陰性表達(dá)，B為散在弱陽性表達(dá)，C為彌漫中等或強(qiáng)陽性表達(dá)。D-F為T細(xì)胞淋巴瘤代表性病例表達(dá)情況。D為陰性表達(dá)，E為散在弱陽性表達(dá)，F(xiàn)為彌漫強(qiáng)陽性表達(dá)

表1 5hmc在非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)情況

對B細(xì)胞淋巴瘤和T細(xì)胞淋巴瘤病例進(jìn)行5hmc表達(dá)率的比較，結(jié)果顯示T細(xì)胞淋巴瘤中5hmc陰性率高于其在B細(xì)胞淋巴瘤中的陰性率(P<0.05),提示5hmc在T細(xì)胞淋巴瘤比在B細(xì)胞淋巴瘤中缺失更為普遍。

3 討論

本研究檢測了5hmc蛋白在常見的非霍奇金淋巴瘤(高侵襲性大B細(xì)胞淋巴瘤和T細(xì)胞淋巴瘤)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)和實體瘤類似，非霍奇金淋巴瘤5hmc缺失率高，淋巴瘤中CpG島甲基化現(xiàn)象普遍，而且T細(xì)胞淋巴瘤比B細(xì)胞淋巴瘤的5hmc缺失率更高。TERT基因家族蛋白與5hmc關(guān)系最為密切，髓系白血病和T細(xì)胞白血病出現(xiàn)TERT家族基因突變可導(dǎo)致5mc無法被氧化成為5hmc[9]，也有研究顯示T細(xì)胞淋巴瘤中5hmC缺失與上述突變基因之間并無對應(yīng)關(guān)系[10]。

5hmc免疫表達(dá)情況或可成為檢測淋巴瘤DNA甲基化狀態(tài)的評估指標(biāo)之一。 5mc氧化過程可分為主動氧化和被動氧化，主動氧化途徑經(jīng)TET基因家族蛋白催化生成5hmc[3]，因此通過檢測5hmc可以提示DNA去甲基化的狀態(tài)。5hmc蛋白定位于細(xì)胞核，免疫組化簡便易行而且判讀方便，因此可將免疫組化方法作為5hmc相關(guān)表觀遺傳學(xué)研究的初步篩選途徑。

本研究不足之處在于所選擇淋巴瘤亞型以及病例數(shù)有限，在未來的研究中需要增加病例數(shù)量，并且觀察5hmc對預(yù)后和化療效果的影響，以提高結(jié)論的準(zhǔn)確性。