岳賢文，劉珊珊，王會東

（1.濰坊呼吸病醫(yī)院 放射科，山東 濰坊；2.濰坊市人民醫(yī)院 心內(nèi)一科，山東 濰坊；3.濰坊市人民醫(yī)院 乳腺外科，山東 濰坊）

本次研究主要通過對人體非小細胞癌細胞系的H1975以及A549 進行研究，從而了解敲低HOTTIP 對惡性腫瘤細胞的增殖、遷移的抑制效果。待此兩種細胞系的細胞性狀穩(wěn)定后，將所有細胞轉(zhuǎn)移至RPMI1640 培養(yǎng)基上進行繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中預先加入適量10%胎牛血清與抗菌-抗真菌劑混合溶液?？刂普w溫度為37 ℃，并調(diào)整整體培養(yǎng)環(huán)境為5%二氧化碳與95%空氣，連續(xù)培養(yǎng)，將其作為研究對照組。

我們首先通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRTPCR）對正常人體組織以及腫瘤病灶組織中的HOXA 基因簇末端轉(zhuǎn)錄物即是HOTTIP 的相對表達進行詳細檢測分析，同時為分析了解HOTTIP 對A549 以及H197 癌細胞的影響，通過使用RNA 干擾技術(shù)合成用于對HOTTIP 形成干擾表達的si-HOTTIP 以及其陰性對照。使用lipofectamine3000 試劑將si-HOTTIP 以及HOTTIP 轉(zhuǎn)染進入H1975 與A549 細胞中，從而完成對HOTTIP 低表達細胞體的構(gòu)建。并將兩組細胞分別分為si-HOTTIP 組以及si-NC 組。

對所有細胞的轉(zhuǎn)染完成后，對HOTTIP 在RNA 的表達量進行測定，測定方法主要使用qRT-PCR 技術(shù)完成對所有組別細胞中HOTTIP 相對表達量的測定，其后根據(jù)表達量計算出相應的轉(zhuǎn)染效率。通過細胞計數(shù)盒-8（CCK-8）分別評測了“對照組”“si-HOTTIP 組”和“si-NC 組”A549和H1975 細胞的活力。使用異硫氰酸熒光素以及硫化丙啶雙重染色法完成對各組細胞的凋亡率檢測，并通過蛋白質(zhì)印跡完成對各組細胞中蛋白Bax、cleaved-Caspase-3 以及cleaved-Caspase-9 蛋白表達情況，此三種蛋白主要負責促進細胞凋亡，通過了解細胞中此類蛋白的表達情況即可了解細胞組的凋亡率情況。同時，了解細胞組中的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB/AKT）信號通路和絲裂原活化蛋白激酶（AMPK）信號通路中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，包括總PI3K 蛋白（t-PI3K）、磷酸化PI3K 蛋白（p-PI3K）、總AKT 蛋白（t-AKT）和磷酸化AKT 蛋白（p-AKT）、磷酸化蛋白AMPK（p-AMPK）和總蛋白AMPK（t-AMPK）的表達情況[1]。其后使用ImageLabTM圖像處理軟件完成兩種細胞p/t-PI3K 以及p/t-AMPK 條帶量化分析處理。此次研究主要使用β-actin 蛋白作為研究比對中的內(nèi)部參照，并分別使用Transwell 細胞培養(yǎng)小室以及24 孔Millicell 懸掛式細胞培養(yǎng)小室完成對不同細胞組的細胞處理后遷移、侵襲能力測定，所有研究中測定均在相同條件下至少重復3 次并取平均值，以保證研究測定的準確性與有效性。使用SPSS 24.0 軟件完成此次研究中所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析處理，并將數(shù)據(jù)結(jié)果使用平均值±標準差進行表示，其中P 值使用單因素方差分析法進行計算。

為探明敲除HOTTIP 在NSCLC 患者病理學機制中的影響情況，此次研究將使用對照組與si-HOTTIP 組、si-NC 組中A549 以及H1975 細胞中miR-206 表達情況了解HOTTIP對NSCLC 患者病理學機制的影響以及其與miR-206 的影響關(guān)系。同時通過合成抑制miR-206 蛋白表達的相關(guān)抑制因子以及陰性對照NC 抑制因子，可將其轉(zhuǎn)染至兩種細胞中，形成對應處理組，并進一步了解miR-206 對HOTTIP 的介導功能。此外本次研究使用qRT-PCR 技術(shù)將確定所有處理組轉(zhuǎn)染后的轉(zhuǎn)染效率情況，了解此種方法的實際應用價值。

此次研究同時還將利用C C K-8 檢測對照組、s i-N C+N Cin 組、si-HOTTIP+NCin 組、si-HOTTIP+miR-206in組中A549 以及H1975 細胞的獲利情況。并主要使用通過AnnexinV-FITC/PI 雙染色法以及流式細胞檢測技術(shù)完成對各組細胞凋亡率的檢測情況，并使用上述蛋白質(zhì)免疫印跡法ImageLabTM圖像處理軟件與完成對細胞各蛋白表達的測定，與帶量化分析。

為確定EGFR 與miR-206 的關(guān)系，此次研究通過雙熒光素酶進行檢測試驗，測定miR-206mimic、NCmimic、EGFR-wt、突變型-EGFR 以及細胞轉(zhuǎn)染情況，形成“miR-206mimic+EGFR-wt”組、“NCmimic+EGFR-wt”組、“miR-206mimic+EGFR-mut”組和“NCmimic+EGFR-mut”組。通過細胞凋亡檢測后可知，A549 以及H1975 細胞中，對照組和si-NC 組凋亡率相類似，且si-HOTTIP 組細胞凋亡率明顯較si-NC 組細胞更高，組間差異顯著（P＜0.05）。敲低HOTTIP表達使Bax、cleaved-caspase3 和cleaved-caspase9 表達量明顯較si-NC 組更高，組間差異顯著（P＜0.05）。且si-NC 組與對照組細胞間并未出現(xiàn)顯著性差異。

通過對細胞實施遷移與侵襲檢測后可知，相較于對照組，轉(zhuǎn)染si-NC 對細胞遷移率無明顯影響。相較于si-NC 組，轉(zhuǎn)染si-HOTTIP 可使細胞相對遷移率明顯下降。且對照組與si-NC 組細胞間無明顯相對侵襲率差異。相對于si-NC組細胞，si-HOTTIP 組細胞相對侵襲率明顯更低（P＜0.05）。

通過Westernblot 檢測后可知，在A549 細胞中，si-NC 組細胞內(nèi)p-AKT 蛋白表達量與p/t-PI3K 和p/t-AKT 明顯更高，組間差異顯著（P＜0.05）。而對照組與si-NC 組細胞間無明顯差異（P＞0.05）。同時，對H1975 細胞，對照組與si-NC 組t-PI3K以及t-AKT 蛋白表達量均無明顯變化。而對A549 細胞，對照組細胞與si-NC 組細胞中蛋白表達情況以及p/t-AMPK 幾乎相同，si-HOTTIP 組細胞p-AMPK 表達與p/t-AMPK 表達明顯較si-NC 組細胞更低，組間差異顯著（P＜0.05）。

Westernblot 檢測EGFR 蛋白的表達顯示，對A549 細胞和H1975 細胞而言，“對照組”和“si-NC+NCin”組結(jié)果相同；但“si-NC+NCin”處理組EGFR 蛋白表達量明顯較干擾HOTTIP 更 高（P＜0.05）；與“si-HOTTIP+NCin”處 理 組相比，“si-HOTTIP+miR-206in”處理組細胞中，EGFR 蛋白表達量將在敲低HOTTIP 沉默miR-206 的表達后明顯升高（P＜0.05）。

雙熒光素酶報告結(jié)果顯示，相較于對照組，共轉(zhuǎn)染NCmimic 和EGFR-wt 后，細胞中熒光素酶相對活力無明顯變化；同時共轉(zhuǎn)染miR-206mimic 和EGFR-wt 后，細胞中熒光素酶活力明顯下降，組間差異均具有顯著性（P＜0.05）。此外，無論是共轉(zhuǎn)染NCmimic 和EGFR-mut 亦或是共轉(zhuǎn)染miR-206mimic 和EGFR-mut，相較于對照組，經(jīng)過檢測后發(fā)現(xiàn)細胞中所存在的熒光素酶相對活性未出現(xiàn)明顯改變。

敲低HOTTIP 對于細胞凋亡具有一定促進作用，主要是通過上調(diào)表達miR-206 抑制NSCLC 細胞增殖、遷移和侵襲的方式達到促進目的，其中EGFR 可作為miR-206 的作用靶點[2]。此外此次研究結(jié)果顯示，HOTTIP、miR-206 和EGFR在NSCLC 細胞系兩種細胞，均有較為顯著的作用，旨在為其他醫(yī)學從業(yè)人員深入研究提供一定參考，為臨床治療方向提供新的思路。