鄭少玲

（福建省仙游縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，福建 仙游351200）

液體菌種具有制種時間短、接種效率高，定植封面快、發(fā)菌周期短，生產(chǎn)成本低、自動化程度高，出菇整齊度高、產(chǎn)品品質好的特點[1]，備受食用菌工廠化生產(chǎn)廠家的推崇。金針菇液體菌種已得到普遍應用，杏鮑菇液體菌種也逐漸替代固體菌種，但海鮮菇液體菌種僅有少數(shù)企業(yè)在使用，大多處于研究探索階段[2]。海鮮菇液體菌種應用于工廠化袋式栽培，接種后菌絲12 h 萌發(fā)，24 h 封面，菌包發(fā)菌培養(yǎng)時間比使用固體菌種約提早10 天，出菇整齊度好，產(chǎn)品品質較優(yōu)，產(chǎn)量相當。為促進海鮮菇液體菌種生產(chǎn)應用，本文簡要介紹其生產(chǎn)流程、各級菌種制作技術要點及質量要求。

1 生產(chǎn)方式與流程

液體菌種生產(chǎn)采用母種（一級種）、搖瓶菌種（二級種）和種子罐菌種（三級種）分級生產(chǎn)方式。各級菌種生產(chǎn)均要按培養(yǎng)基配制、滅菌、冷卻、接種、培養(yǎng)至成品的流程進行規(guī)范操作，但不同級別菌種的制作技術要求有所差異。

2 母種制備

母種是液體菌種生產(chǎn)的基礎，也是液體菌種制作成功與否的關鍵。母種分為種源母種與生產(chǎn)母種，種源母種應從具備母種（一級種）生產(chǎn)經(jīng)營許可資質的單位引進，由種源母種擴繁為生產(chǎn)母種，擴繁代數(shù)以不超過5 代為宜。

2.1 母種培養(yǎng)基配方與制備方法

母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯350 g、葡萄糖30 g、瓊脂20～25 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g，潔凈水1 000 L，pH 6.0～6.5。

根據(jù)配方按常規(guī)PDA 培養(yǎng)基制作程序進行配制、滅菌、冷卻。不同之處在于分裝容器需使用克氏瓶。與試管相比，克氏瓶表面較寬，能清晰看出菌絲長勢，判斷菌種優(yōu)劣；與培養(yǎng)皿相比，克氏瓶用棉花塞封口，通透性好，可為菌絲生長提供充足氧氣。1 000 mL 培養(yǎng)基分裝15 個500 mL 克氏瓶，培養(yǎng)基厚度0.5 cm。培養(yǎng)基太薄，易導致培養(yǎng)基干裂影響菌絲生長；太厚，豎放克氏瓶時易引起培養(yǎng)基塌落。

2.2 接種與培養(yǎng)

克氏瓶母種按無菌操作規(guī)范接種后，置于22 ℃、空氣相對濕度（低于）55%～60%、通風、避光條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)至13 天時菌絲生長直徑約8 cm，便可用于生產(chǎn)搖瓶菌種。溫度是克氏瓶母種培養(yǎng)關鍵因素，不可過高、過低或忽高忽低。培養(yǎng)過程應定期檢查，及時淘汰不合格母種。

2.3 質量檢測

克氏瓶母種質量檢測包括感官觀察、顯微檢驗、雜菌檢驗與生長速度測定等。通過感官觀察克氏瓶有無破損，棉塞是否規(guī)范，培養(yǎng)基厚度、均勻度與顏色，以及有無雜菌、螨蟲等。如果發(fā)現(xiàn)母種容器破損，菌絲生長不整齊，有缺角，發(fā)黃、變褐等現(xiàn)象，必須及時淘汰。顯微檢驗先用10 倍物鏡觀察菌絲粗細，再用40 倍物鏡觀察形態(tài)特征、鎖狀聯(lián)合等。若觀察到菌絲較細，菌絲直徑小于1.8 μm，沒有鎖狀聯(lián)合的，這類菌絲基本上是單核菌絲，不會出菇，應予以淘汰。雜菌檢測主要檢測細菌與霉菌，采用回接方法觀測，如被感染必須淘汰。生長速度是反映菌種活力的重要指標，記錄菌絲生長速度，22 ℃條件下培養(yǎng)13 天，菌絲直徑約為8 cm，如出現(xiàn)明顯偏差，應追究原因。

3 搖瓶菌種制備

搖瓶菌種相當于固體菌種的原種（二級種），是將母種接種在液體培養(yǎng)基上進行搖瓶培養(yǎng)而成。

3.1 搖瓶菌種培養(yǎng)基制備

搖瓶菌種培養(yǎng)基配方：白砂糖20 g、豆粕粉3.3 g、磷酸二氫鉀0.66 g、硫酸鎂0.66 g，潔凈水1 000 mL，pH 6.0～6.5。

依照配方將配制好的培養(yǎng)基分裝至1 000 mL三角瓶中[3]，每瓶裝600 mL。分裝培養(yǎng)基后的三角瓶瓶口塞上棉塞，棉塞外用鋁箔紙或牛皮紙包裹，放入高壓鍋進行滅菌。滅菌溫度121 ℃，壓力0.15 MPa，時間40 min，待冷卻至18～22 ℃后再接種。

3.2 接種與培養(yǎng)

接種嚴格遵循無菌操作規(guī)范，接種時先去除克氏瓶內老菌塊，刮去表面1/2 的氣生菌絲，然后切成0.25×0.25×0.5（cm）接種塊，每三角瓶接20～30 個接種塊，每個克氏瓶母種接2～3 個三角瓶。接種后，將三角瓶放入搖床振蕩培養(yǎng)，轉速150 r/min，培養(yǎng)溫度21～23 ℃，培養(yǎng)時間6～7 天，即得搖瓶菌種。

3.3 質量檢測

搖瓶菌種質量檢測采用感官觀察與取樣檢測相結合的方法。感官觀察包括澄清度、菌絲球狀態(tài)和氣味等，取樣檢測包括顯微觀察和pH 測定[3]。感官觀察時需將三角瓶靜止30 min，優(yōu)良菌種表現(xiàn)為菌球下沉，上清液澄清透明，表面無或僅有少量泡沫，菌球顆粒大小均勻，菌球表面菌絲呈發(fā)散狀，有海鮮菇菌絲特有的清香味。取樣檢測需將菌液涂布載玻片，置于10×40 倍光學顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)是否粗壯、豐滿、均勻，是否具有鎖狀聯(lián)合，以此判斷菌種優(yōu)劣。正常pH 為5.6～6.1，如低于5.6，則搖瓶菌種可能被污染。

4 種子罐菌種制備

種子罐菌種相當于固體菌種的栽培種（三級種），是由搖瓶菌種接種在培養(yǎng)罐液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)而成。

4.1 種子罐菌種培養(yǎng)基制備

種子罐菌種培養(yǎng)基配方：白砂糖14 kg、豆粕粉2.31 kg、磷酸二氫鉀462 g、硫酸鎂462 g，水700 L，泡敵60 mL，pH 6.0～6.5。

按配方配制的培養(yǎng)液倒入經(jīng)消毒的空培養(yǎng)罐內，裝料量為培養(yǎng)罐80%，鎖好培養(yǎng)罐各管口閥門，并檢查是否漏水、漏氣[4]。然后置于滅菌鍋內滅菌，105 ℃保溫20 min，升溫至121 ℃保溫50 min。待滅菌鍋壓力降為0 MPa 時方可打開鍋門，通水冷卻30 min 左右，移至冷卻室進行冷卻。

4.2 接種與培養(yǎng)

將冷卻至19～23 ℃的種子罐移到層流罩下，接通進氣管，進氣壓力保持0.05 MPa，打開層流罩和紫外燈開關30 min，在培養(yǎng)罐的接種口上放置95%的酒精火焰圈套，關閉進氣閥門，打開出氣閥門，使培養(yǎng)罐壓力保持0 MPa。點燃火焰圈，打開種子罐上蓋，并提起移至火焰旁邊，將經(jīng)檢測合格的搖瓶菌種倒入種子培養(yǎng)罐中，蓋上種子罐上蓋，打開種子罐進氣閥、關閉出氣閥，待罐體壓力達到0.05 MPa 時，關閉進氣閥再移回培養(yǎng)位置培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度20～22 ℃，培養(yǎng)時，將排氣閥全打開，調節(jié)進氣壓力在1.0～1.2 MPa，培養(yǎng)時間6～7 天。

4.3 質量檢測

種子罐菌種質量檢測除感官觀察、取樣檢測外，還需檢測種子罐內CO2濃度變化和菌絲量情況。感官觀察時，依次關閉出氣閥和進氣閥，待菌液不再翻騰時進行靜止觀察。優(yōu)良菌種表現(xiàn)菌球下沉，上清液澄清透明，表面無或有少量泡沫，菌球表面菌絲呈發(fā)散狀；接種后培養(yǎng)1～3 天的種子罐排氣的氣味為糖豆香味，3～4 天時糖香味轉為清香味，隨后5～6 天時清香味轉濃，7 天時開始轉淡，呈現(xiàn)海鮮菇菌種所特有的氣味。取樣檢測需取菌液涂布載玻片，置于10×40 倍光學顯微鏡下，觀察菌絲是否粗壯、豐滿、均勻，是否具有鎖狀聯(lián)合，以此判斷菌種優(yōu)劣。正常pH 為5.6～6.1，如低于5.6，培養(yǎng)罐菌種可能被污染。CO2濃度檢測需用特制容器，在出氣口先排盡容器內空氣，然后收集種子罐內CO2進行檢測。CO2濃度低于1.5%、高于4%屬于不正常情況，可能被雜菌污染。采用4 500 r/min離心機分離菌液中菌絲體，以10 mL 菌液中含有1～1.5 g 菌絲量（鮮重）較理想。

5 液體菌種的使用與貯存

海鮮菇搖瓶菌種、種子罐菌種制成后，經(jīng)檢驗合格，應立即使用。若遇特殊情況，不能及時使用，需降溫保壓存放。一般在12～15 ℃以下可保存2～3 天，10 ℃以下可存放3～5 天[5]。