張倩倩， 楊 鵬， 陳 靜， 尹德晶， 程振濤*

(1. 貴州省銅仁市萬(wàn)山區(qū)飼料監(jiān)測(cè)與藥政監(jiān)察站，貴州 萬(wàn)山 554200； 2. 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

2020年3月，貴州省仁懷市某養(yǎng)殖場(chǎng)仔豬陸續(xù)出現(xiàn)不明原因死亡病例，病豬初期出現(xiàn)食欲減退、消瘦、生長(zhǎng)緩慢、喘氣、咳嗽等癥狀，隨后發(fā)生急性死亡。該場(chǎng)共有仔豬600余頭，1個(gè)月內(nèi)相繼發(fā)病仔豬20頭，死亡16頭，發(fā)病率3.33%(20/600)，病死率80%(16/20)。為了查明病因，特進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)診斷。

1 材料與方法

1.1 檢測(cè)病料無(wú)菌采集2頭病死仔豬的新鮮心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結(jié)作為檢測(cè)病料。

1.2 主要試劑及儀器(1)主要試劑：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒(CSFV)通用型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自北京世紀(jì)元亨公司)，DNA/RNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker試劑(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)，鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司)。(2)主要儀器：熒光定量PCR儀Line-genek(購(gòu)自杭州博日科技有限公司)、電泳凝膠成像儀SYGENE(購(gòu)自Gene公司)。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌操作取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟新鮮組織樣品，分別劃線接種鮮血營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果。

1.4 組織樣品DNA、RNA提取取肺臟、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)病料各1 g于滅菌研缽，加入生理鹽水1.5 mL 快速研磨，勻漿后轉(zhuǎn)入1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min 離心2 min，取上清液100 μL，按說(shuō)明書方法用DNA/RNA試劑盒室溫環(huán)境提取總DNA和RNA。

1.5 相關(guān)病毒核酸檢測(cè)

1.5.1 PRRSV核酸檢測(cè)以提取的總RNA為模板，構(gòu)建RT-PCR反應(yīng)體系25 μL：無(wú)菌無(wú)核酸酶水5 μL，RT-PCR反應(yīng)液12.5 μL，酶混合液1.0 μL，熒光探針4.5 μL，模板RNA 2 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)第2步收集熒光信號(hào)。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，以Cq值≤35并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性。

1.5.2 CSFV核酸檢測(cè)以提取的總RNA為模板，構(gòu)建RT-PCR反應(yīng)體系25 μL ：無(wú)菌無(wú)核酸酶水7.1 μL，RT-PCR反應(yīng)液12.5 μL，酶混合液1.0 μL，熒光探針2.4 μL，模板RNA 2 μL。反應(yīng)條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，共40個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)第2步收集熒光信號(hào)。根據(jù)陽(yáng)性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，以Cq值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線判定為陽(yáng)性。

1.5.3 豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)核酸檢測(cè)以提取的總DNA為模板，采用PCR方法進(jìn)行PCV-2檢測(cè)。PCR擴(kuò)增體系25 μL：2×TaqMixture 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物(PCV2-P1：5’-AAGGGCT GGGTTATGGTATG-3’；PCV2-P2：5’-CGCTG GAGAAGGAAAAATGG-3’)各1 μL，模板DNA 2 μL，滅菌雙蒸水8.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35次；72 ℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物8 μL于含核酸染料的1.2%瓊脂糖凝膠上電泳(110 V，25 min)，于凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果(預(yù)擴(kuò)增片段353 bp)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)2頭仔豬各組織樣品中均未分離到細(xì)菌，表明無(wú)細(xì)菌感染。

2.2 PRRSV核酸檢測(cè)由圖1可見：陽(yáng)性對(duì)照Cq值為11，而2份檢測(cè)樣品Cq值均<35且有明顯擴(kuò)增曲線，表明組織樣品中存在PRRSV感染。

2.3 CSFV核酸檢測(cè)由圖2可見：陽(yáng)性對(duì)照Cq值為20，而2份檢測(cè)樣品Cq值均>30，且無(wú)明顯擴(kuò)增曲線，說(shuō)明組織樣品中不存在CSFV感染。

2.4 PCV-2核酸檢測(cè)由圖3可見：2份檢測(cè)樣品PCR擴(kuò)增均出現(xiàn)353 bp 目的基因片段，與陽(yáng)性對(duì)照相符，表明存在PCV-2感染。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)病死仔豬病料進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定和相關(guān)病毒核酸檢測(cè)，確診該豬場(chǎng)病例存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型混合感染。

4 討論

由PRRSV引起的豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)是1種急性高致死性傳染病，主要引起母豬繁殖障礙、仔豬肺炎等[1]。PCV-2是圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬的1種無(wú)囊膜、共價(jià)閉環(huán)單股DNA病毒(ssDNA)，可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征以及生殖系統(tǒng)疾病[2，3]。近年來(lái)，豬的疫病日趨復(fù)雜，混合感染也越來(lái)越普遍，尤其是PRRSV、PCV-2混合感染最為嚴(yán)重[4]。Pallares F J等[5]對(duì)369份臨床PMWS病例進(jìn)行病原分析顯示，PRRSV與PCV-2混合感染率達(dá)到51.9%，只感染PCV-2的病例僅占1.9%。賈赟等[6]對(duì)來(lái)自華東地區(qū)4省市的67份PCV-2陽(yáng)性病料進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)較嚴(yán)重的二重感染，其中PRRSV與PCV-2二重混合感染占樣品總數(shù)的52.3%。羅黛青[7]檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，云南省東川地區(qū)豬疫病的單純感染情況越來(lái)越少，混合感染越來(lái)越多，CSFV和PRRSV混合感染呈上升趨勢(shì)。由此可見，豬群中PRRSV與PCV-2的混合感染已非常普遍，已成為嚴(yán)重危害豬群的混合感染性疫病。PCV-2和PRRSV均屬于免疫抑制性病毒，豬群感染后免疫系統(tǒng)受損，免疫機(jī)能下降，二者的協(xié)同并發(fā)加重了豬免疫機(jī)能下降的程度，易造成其他疫病的繼發(fā)感染，嚴(yán)重影響生豬生產(chǎn)[8]。