嚴梅，黃金霞，楊朝

（1.寧夏醫(yī)科大學，寧夏 銀川；2.蘇州科技城醫(yī)院，江蘇 蘇州）

0 引言

特發(fā)性肺纖維化( Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF) 是一種原因不明的慢性進行性纖維化性間質性肺炎，表現(xiàn)為漸進性呼吸困難和肺功能惡化，肺組織學和/或影像學表現(xiàn)為普通型間質性肺炎( usual interstitial pneumonia，UIP)[1]。IPF 的死亡率較高，中位生存期僅為3-5 年[2]。其發(fā)病機制尚不明確，目前認為肺泡上皮細胞(alveolar epithelial cells，AECs) 的損傷和異常修復，細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的異常沉積以及纖維細胞的增殖和活化[3-5]共同參與IPF 的發(fā)病過程，導致肺部結構破壞和呼吸功能的喪失。

基質金屬蛋白酶( matrixmetalloproteinases，MMPs) 是一類依賴于Zn2+和Ca 2+的蛋白水解酶，其催化活性位點中具有保守的鋅結合基序，能夠降解ECM[6]，且在細胞增殖、遷移、凋亡、血管生成、組織再生和免疫應答中起重要作用[7]?；|金屬蛋白酶-28 ( matrix metalloproteinase28，MMP-28) 是MMPs 家族中最新的成員之一，目前有關MMP-28 研究正處于起步階段，對于MMP-28 的結構、表達、功能以及調節(jié)等機制尚未完全闡明。據報道，MMP-28 在皮膚癌、肝癌和某些心臟疾病(如急性心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛) 中表達上調[8-12]。而MMP-28 在IPF 的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及潛在應用價值尚未見報道，現(xiàn)對MMP-28 的結構、調節(jié)及其在肺纖維化中的作用進行綜述。

1 MMP-28 的結構

MMPs 是一類結構上高度保守的鋅依賴性內肽酶，至少包含三個結構域，信號肽與前肽區(qū)結構域、催化結構域以及通過鉸鏈區(qū)連結的血紅素結合蛋白樣C 末端結構域，三個區(qū)域各有特殊功能[13-14]。MMP-28 最初是從人類角化上皮和睪丸的cDNA 文庫中克隆而來，相對分子量為59Kd，可編碼520 個氨基酸序列。對MMPs 的氨基酸序列進行對比后發(fā)現(xiàn)，MMP-28 與MMP-19 具有同源相似性，推斷其為MMP-19 的一個亞族[15]。MMP-28 包含了所有MMP 典型的結構域，疏水信號肽結構域后緊接著包含PRCGVTD 的前肽結構域，前肽序列C 末端有一其獨有的弗林蛋白酶激活序列RRKKR，表明MMP-28 可被弗林蛋白在細胞內激活[15-16]。MMP-28 的催化結構域是可溶性MMP 所具有的典型結構，但在催化序列HEIGHTLGLTH 中含有其他MMPs 所沒有的蘇氨酸[17]。另外還包括鉸鏈區(qū)及其后的血紅素樣結構域。此外，MMP-28 的啟動子在結構上具有特異性，其轉錄起始位點沒有TATAbox 或cCAAT 序列，且具有“半胱氨酸開關”。MMP-28 的啟動子需特異性結合sp 家族的轉錄因子GT-box 序列才能進一步啟動其活性[18]。因此，與MMPs 中其它的成員相比，MMP-28 在結構上具有一定的相似性，但又有明顯的不同之處，提示其在機體生理及病理過程內具有獨特功能。

2 MMP-28 與特發(fā)性肺纖維化

IPF 是一種起始原因不明的異常生物學進程，過量的ECM 沉積于肺內，導致反復的AECs 損傷、肺組織修復以及周圍血管新生重構異常，使肺泡正常功能喪失，最終引起肺組織變形、瘢痕組織形成及肺功能受損[19]。IPF 患者的血和肺組織中MMP-28 水平升高及肺纖維化動物模型的肺組織中MMP-28 含量增加均提示MMP-28 與肺纖維化相關[20,23]。另外研究還發(fā)現(xiàn)MMP-28 在博來霉素誘導的小鼠肺纖維化模型中表達上調，而MMP-28-/-小鼠不會出現(xiàn)肺纖維化表現(xiàn)，提示了它的促纖維化作用[20]。

2.1 來源

MMP-28 在人的基底部皮膚、基底上部的角化細胞、精原細胞以及神經細胞發(fā)育過程中高表達[15]。在肺內同樣有著MMP- 28 群體的存在，在小鼠體外肺組織以及流感病毒感染模型中，已經證明MMP-28 由促進上皮細胞存活的Club 細胞表達[21-22]。而在IPF 患者肺組織中，免疫組化顯示MMP-28 在AECs 表達強陽性，提示AECs 分泌MMP-28[23]。Maldonado 等人同樣發(fā)現(xiàn)MMP-28主要由上皮細胞表達，特別是AECs 和支氣管上皮細胞(bronchial epithelial cells，BECs)，且定位于BEC 頂端和細胞質以及AECs 細胞質和核內[20,24]。

2.2 作用機制

2.2.1 促進炎癥反應

在肺纖維化的早期炎癥階段，主要表現(xiàn)為上皮細胞脫落、炎癥細胞浸潤和細胞因子調控失衡，巨噬細胞是最早分泌炎癥因子參與IPF 致病過程的細胞之一。按其功能可分為M1 型和M2 型，Ml 型分泌促炎因子和趨化因子，而M2 型分泌抗炎因子并清除肺內炎性細胞，發(fā)揮其抗炎作用，M1/M2 失衡參與肺部炎癥反應的調控[25]。在一項動物模型試驗中，敲除MMP-28 基因的小鼠肺組織MMP-28 表達水平下降，巨噬細胞M2 表型極化降低，且與野生型小鼠相比，博來霉素誘導的肺纖維化程度減弱[26]。Manicone 等人發(fā)現(xiàn)暴露于慢性香煙煙霧的MMP-28-/- 小鼠炎癥反應減弱，且不發(fā)生肺氣腫，部分原因可能是由于巨噬細胞M2 型水平降低，提示MMP-28 可促進肺部慢性炎癥及組織重構[27]。為了闡述調控巨噬細胞表達MMP-28 的信號分子，研究人員用LPS 及 poly(I：C) 刺激巨噬細胞，發(fā)現(xiàn)MMP-28 表達增加依賴于TRIF- 和I 型IFN，且MMP-28-/-小鼠巨噬細胞中CCL 2、CCl 4、cxcl 10 和IL 6 的表達增加，提示巨噬細胞整合了TRF-和I 型IFN 依賴性信號通路通過調節(jié)MMP-28 的表達參與了ECM 的修飾[28]。

2.2.2 促進細胞增殖

反復的AECs 損傷和AEC 層的破壞可觸發(fā)肺組織纖維化反應，受損的上皮細胞不能參與正常的組織重塑以及重建正常上皮屏障，且肌成纖維細胞的異常增殖以及循環(huán)細胞進入肺組織，促進了纖維化進程[29]。Saarialho 等人發(fā)現(xiàn)上皮細胞損傷后，TNF-α 通過NF-kB 通路產生的級聯(lián)效應調節(jié)MMP-28 的產生[30]。此外，MMP-28 在AECs 中的過表達顯著提高了其生長和增殖速率，與之相反的是，當MMP-28 基因沉默時，其生長和增殖率顯著降低。同樣，將人MMP-28 轉染大鼠AECs 后，其生長和增殖率也顯著升高。對于原代人BECs，沉默MMP-28 基因也觀察到細胞生長和增殖率顯著降低[20]。因此，MMP-28 在IPF 表達增加，并且以一種催化劑依賴的方式促進上皮細胞的增殖及表型的轉化從而發(fā)揮促纖維化作用。

2.2.3 促進間充質轉化

肺纖維化發(fā)病過程中的關鍵因素還包括肺泡上皮的損傷和成纖維細胞相互作用以及上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[31]。EMT 通過其上游相關信號通路引起纖維化效應，其中TGF-β 及其有關蛋白是最重要的細胞因子，而MMP-28可通過誘導TGF-β 的表達介導EMT 的發(fā)生，干預或阻斷EMT 的相關效應分子，可抑制肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，為延緩IPF 進展提供了一個新思路[32-33]。通過在A549 肺腺癌細胞中表達重組MMP-28，發(fā)現(xiàn)細胞表面E- 鈣粘蛋白丟失，潛在TGF-β 復合物水解增多和活性TGF-β 水平的增加，均導致了穩(wěn)定且不可逆的EMT，而MMP 抑制劑GM6001 或中和TGF- 活性的抗體可阻止導致EMT產生的一系列級聯(lián)反應。一旦EMT 發(fā)生，細胞表型的轉化不能被MMP 抑制劑逆轉[34]。并且MMP-28 也可以通過激活Notch3 信號通路促進EMT 的發(fā)生[35]。

2.2.4 抑制細胞凋亡

細胞凋亡抵抗是肺纖維化進行性發(fā)展的重要原因之一，其中損傷的AECs 持續(xù)累積會影響細胞干性，從而出現(xiàn)細胞凋亡或衰老失控，另外在損傷修復階段，肌成纖維細胞持續(xù)存在且存在凋亡缺陷，當衰老組織細胞不能被免疫細胞清除，大量累積并分泌細胞因子改變微環(huán)境，對肺纖維化有促進作用[36-38]。Manicone 等人在兩個肺上皮細胞系(A549 和BEAS-2b) 中培育了正常表達的野生型和無催化活性的突變型MMP-28 細胞系，不論在血清剝奪或者使用蛋白酶抑制劑十字孢堿誘導細胞凋亡的實驗中，觀察到MMP-28 的過度表達對細胞凋亡具有保護作用。此外，與野生型小鼠相比，來自流感感染MMP-28-/- 小鼠的肺組織中caspase-3/7 活性增加，這種活性局限于氣道上皮，但與病毒載量的變化無關。因此，確定了MMP-28 在促進肺上皮細胞存活中的新作用[22]。同樣，在膠質瘤細胞中MMP-28 的上調通過激活TGF-β 來誘導細胞生長并減少膠質瘤細胞的凋亡。此外，TGF-β抑制劑則減弱了MMP-28 在膠質瘤細胞中的作用[39]。

2.2.5 促進細胞遷移

在各種損傷因素的刺激下，肺組織多種細胞被激活，經過上皮細胞基膜的間隙遷移至肺泡損傷處，并在該處沉積、增殖以及分泌ECM，啟動損傷修復過程，最終導致肺纖維化[40-41]。在劃痕愈合試驗中高表達的MMP-28 增強了上皮細胞通過I 型膠原包被的Boyden 室進行的細胞遷移，且抑制鈣粘蛋白的表達，促進纖維連接蛋白的表達，而用shRNA 沉默MMP-28 基因得到相反的結果。為了更深入了解其作用機制，用單氨基酸替代產生的無催化活性MMP-28 突變體則無增強細胞增殖和遷移的能力，因此IPF 中表達的MMP-28 可能以催化依賴的方式增強了上皮細胞的存活、增殖、遷移和EMT[42]。另外分子間伴侶Furin 通過與MMP-28 前肽結構域的YL 基序相互作用，可促進上皮細胞MMP-28 的分泌，將MMP-28 cDNA 轉染COS-1 細胞后，細胞遷移能力增強，證明Furin 共轉染促進細胞的遷移[43]。

3 MMP-28 抑制劑的應用

MMPs 的抑制劑主要分為兩大類，一類為天然組織抑制因子-金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPS)。TIMP 是一種多基因家族的編碼蛋白質，在ECM 降解調節(jié)中發(fā)揮重要的作用，分別為TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3、TIMP-4，MMPS 與TIMPS 的平衡失調與肺纖維化的發(fā)生有關[44-45]。在肺纖維化動物模型中，TIMP-1 和TIMP-2 被誘導高表達[46]。對TIMPS 基因敲除小鼠的研究表明，TIMPS 可通過控制細胞功能來限制ECM 的沉積和減少ECM 的豐度[47-48]。博萊霉素誘導的TIMP1-/-小鼠其肺纖維化反應與野生型小鼠相比無明顯差異，但TIMP1-/- 小鼠的炎癥明顯增加，提示TIMP1 在限制肺損傷后的炎癥中起著關鍵作用[49]。因此，未來可將調控 MMPs 與 TIMPs 之間的平衡作為控制纖維化疾病的新靶點。

另外一類MMPs 抑制劑包括Kruppel 樣因子9(KLF9)，KLF9是參與基因轉錄調控的鋅指蛋白之一，通過多種信號途徑以及與細胞內不同蛋白的相互作用，影響細胞的增殖及凋亡。KLF9 與MMP-28 的啟動子區(qū)可特異性結合，實時定量PCR 和雙熒光素酶試驗表明KLF9 可直接抑制MMP-28 轉錄，而體內增強的MMP-28 表達可減弱由異位KLF9 引起的細胞侵襲和轉移能力的降低，因此KLF9 通過抑制MMP-28 轉錄顯著抑制細胞的侵襲和轉移。將KLF9 應用于IPF 患者延緩肺纖維化的進程尚需進一步驗證[50]。

同時，一些合成的MMP 抑制劑也被開發(fā)出來，但大多數為廣譜抑制劑，同時對多個MMP 都有作用，并可能引起不良的肌肉骨骼副作用，導致其臨床應用受限。目前多西環(huán)素是美國食品藥品監(jiān)督管理局批準的唯一一種MMP 抑制劑，將其應用于IPF 治療尚未進行大規(guī)模的臨床驗證[51]。新一代的生物合成MMP 抑制劑可能顯示出更高的MMP 特異性和更少的副作用，并且可能有助于針對特定的MMP，減少不受限制的組織重塑，從而用于MMP 病理相關疾病的治療。

4 展望

IPF 已成為嚴重威脅人類健康與生命的疾病之一，近年來有逐漸增多趨勢，具有高發(fā)病率及高病死率，臨床上缺乏有效的治療方案。目前有關 MMP-28 的研究尚處于初始階段，關于其在肺纖維化過程中的致病機制仍需進一步探討。相信隨著對MMP-28的深入研究，將會為臨床上IPF 的發(fā)病機制乃至治療提供新思路。