劉霞 曾鳳嬌 于航 白國(guó)輝 田源

1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000；2.貴州省普通高等學(xué)?？谇患膊⊙芯刻厣攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；3.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，貴州 遵義 563000

嗜酸乳桿菌（lactobacillus acidophilus，LA）屬于乳桿菌屬，是革蘭氏陽(yáng)性桿菌，桿的末端呈圓形，乳白色菌落，邊緣卷曲。顯微鏡下觀察可見(jiàn)以單個(gè)、成雙或者短鏈排列［1］。嗜酸乳桿菌為一種廣泛存在于人及動(dòng)物腸道內(nèi)的益生菌，研究表明嗜酸乳桿菌在維持胃腸道的生理功能中發(fā)揮重要作用［2-4］。最新研究發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌與齲病密切相關(guān)，兒童牙菌斑中變形鏈球菌與嗜酸乳桿菌均可作為齲風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中危險(xiǎn)因素的檢測(cè)指標(biāo)［5］；對(duì)齲病微生物的相關(guān)研究表明，微生物的群落組成變化會(huì)影響齲病的臨床進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，嗜酸乳桿菌和戈登鏈球菌的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果與活躍性齲明顯相關(guān)［6］。

細(xì)菌濃度測(cè)定方法有很多，如平板菌落計(jì)數(shù)法、顯微鏡計(jì)數(shù)法、比濁法、分光光度法［7］等，單獨(dú)使用一種方法來(lái)測(cè)定細(xì)菌菌液濃度有其各自的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。本研究試圖通過(guò)兩種方法相結(jié)合的方式來(lái)尋找一種更加簡(jiǎn)便有效的菌液濃度測(cè)定方法。OD600是指某種溶液在600nm波長(zhǎng)處的吸光值，一定濃度范圍內(nèi)，菌液中細(xì)菌濃度與其液體光密度（OD值）成正比，因此可以利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD值來(lái)推測(cè)菌液濃度［8］。平板計(jì)數(shù)法是將檢測(cè)樣品稀釋至相應(yīng)倍數(shù)的液體，再取一定量樣品培養(yǎng)至相應(yīng)固體瓊脂板，形成肉眼可見(jiàn)的單菌落，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和取樣量計(jì)算原樣品濃度。本實(shí)驗(yàn)將OD600與平板計(jì)數(shù)法與時(shí)間相結(jié)合，希望找到一個(gè)更加簡(jiǎn)便有效測(cè)定菌液濃度的方法，為實(shí)驗(yàn)提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株、試劑及儀器 嗜酸乳桿菌（貴州省普通高等學(xué)校口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存）；MRS肉湯（品牌：Solarbio貨號(hào)：M8540），瓊脂粉（索來(lái)寶，北京）；紫外分光光度計(jì)（Backman，德國(guó)）、厭氧培養(yǎng)箱（型號(hào)：BACTRON EZ-2，美國(guó)）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)與鑒定。①培養(yǎng)基配置：MRS固體培養(yǎng)基：稱取MRS肉湯4.8g，瓊脂粉2.8g，溶解于100mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min，冷卻至60℃左右倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿，置4℃冰箱備用。MRS液體培養(yǎng)基：稱取MRS肉湯4.8g溶解于100mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15min備用；②菌種復(fù)蘇及培養(yǎng)：將甘油保種的嗜酸乳桿菌解凍后，超凈臺(tái)內(nèi)用無(wú)菌接種環(huán)取適量菌液采用連續(xù)劃線法接種于MRS固體培養(yǎng)皿上，37℃厭氧箱（80%N2，10%H2，10%CO2）內(nèi)培養(yǎng) 24h；③菌種鑒定：培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)皿，超凈臺(tái)內(nèi)用接種環(huán)在直徑為1mm的菌落上取適量細(xì)菌涂布于載玻片上，進(jìn)行革蘭染色（初染→媒染→脫色→復(fù)染），顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定；④菌種擴(kuò)大培養(yǎng)：超凈臺(tái)內(nèi)取MRS液體培養(yǎng)基于15mL離心管內(nèi)，無(wú)菌接種環(huán)挑取鑒定完成后的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)于離心管中，37℃厭氧箱培養(yǎng)。

1.2.2 嗜酸乳桿菌菌液濃度的測(cè)定。①紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液OD600值：挑取鑒定成功的嗜酸乳桿菌單菌落于裝有MRS液體培養(yǎng)基的離心管中，37℃厭氧箱培養(yǎng)20h，將菌液顛倒均勻后取適量菌液，紫外分光光度計(jì)600nm波長(zhǎng)，以MRS液體培養(yǎng)基作為參照測(cè)定一個(gè)初始OD600值后繼續(xù)培養(yǎng)，再分別于2h、4h、6h、8h（總時(shí)長(zhǎng)分別為 22h，24h，26h，28h），測(cè)定其 OD600值；②平板菌落計(jì)數(shù)：每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定OD600值后，超凈臺(tái)內(nèi)準(zhǔn)備9只15mL離心管，編號(hào)，每管內(nèi)加入0.9mLMRS液體培養(yǎng)基，取0.1mL初始菌液到1號(hào)離心管中，依次類推以10為梯度從102～1010進(jìn)行菌液稀釋，將稀釋后的菌液每管取0.1mL涂布于MRS固體培養(yǎng)皿，37℃厭氧箱培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，可推算出菌液濃度=（菌落數(shù)×稀釋度/0.1CFU/mL）。

2 結(jié)果

2.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)及鑒定結(jié)果 培養(yǎng)皿中嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)良好，肉眼觀為乳白色、凸起、邊緣卷曲的菌落；革蘭染色后顯微鏡下觀察細(xì)菌被染為紫色，呈桿狀，以單個(gè)，成雙或者短鏈排列，為革蘭陽(yáng)性桿菌，證明該細(xì)菌為嗜酸乳桿菌。見(jiàn)圖1。

圖1 嗜酸乳桿菌培養(yǎng)及革蘭染色

2.2 各時(shí)間段OD600與平板菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 分光光度計(jì)測(cè)定液體培養(yǎng)基厭氧培養(yǎng)20h時(shí)OD值為0.784，22h、24h、26h、28hOD 值分別為 1.019、1.094、1.329、1.389，平板菌落計(jì)數(shù)見(jiàn)圖2。不同時(shí)間點(diǎn)OD值、菌液稀釋度及菌落數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，在稀釋倍數(shù)為102～105時(shí)，平板菌落數(shù)均大于200個(gè)，可忽略不計(jì)；當(dāng)厭氧培養(yǎng)22h，OD值達(dá)1.0時(shí)，稀釋107倍后菌落計(jì)數(shù)為3，可計(jì)算出原菌液濃度為3×107/0.1=3×108CFU/mL，將菌液與培養(yǎng)基取等體積稀釋后濃度為1.5×108CFU/mL，即得到0.5號(hào)麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管的細(xì)菌濃度。

圖2 平板菌落計(jì)數(shù)圖

表1 隨時(shí)間變化不同稀釋度的菌落平板計(jì)數(shù)（CFU）

3 討論

抑菌試驗(yàn)是指在體外測(cè)定樣品的抑菌或殺菌能力，常用的方法包括紙片法和最小抑菌濃度法［9］。紙片法又叫抑菌圈法，是將待測(cè)藥物滴在紙片上置于含有一定濃度菌液的瓊脂平板中擴(kuò)散，從而使其周圍的細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制而形成抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小來(lái)判定藥物的抑菌效果。最小抑菌濃度法是將一定濃度的抗菌藥物稀釋至不同濃度后接種受試菌株，通過(guò)測(cè)定菌株在不同濃度藥物培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)情況定量檢測(cè)該藥物的最低抗菌濃度。而不管使用哪種方法，都需要將菌液調(diào)整到一個(gè)適宜的濃度。

細(xì)菌濃度測(cè)定方法有很多，平板菌落計(jì)數(shù)法操作復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，顯微鏡計(jì)數(shù)法需要相應(yīng)儀器；比濁法雖然簡(jiǎn)單，但容易受外界環(huán)境或者培養(yǎng)基顏色影響，準(zhǔn)確性欠佳；分光光度法則需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線［10］。每一種測(cè)定方法都有其相應(yīng)的缺點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所以，將平板菌落計(jì)數(shù)法和分光光度法結(jié)合起來(lái)，觀察菌液隨著培養(yǎng)時(shí)間的變化。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌厭氧培養(yǎng)22h，OD600值達(dá)到1.0時(shí)，稀釋107倍后菌落計(jì)數(shù)為3，可推算出原菌液濃度將菌液與培養(yǎng)基取等體積稀釋后，即得到0.5號(hào)麥?zhǔn)蠞岫葮?biāo)準(zhǔn)管的細(xì)菌濃度。這種方法簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確性較單純比濁法好，且不需要借助特殊儀器，能夠?yàn)槲覀兊幕A(chǔ)實(shí)驗(yàn)提供幫助。