郭水根 舒慧珍

(復旦大學附屬浦東醫(yī)院呼吸內科，上海 201399)

肺腺癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率有升高趨勢，研究肺腺癌的發(fā)病機制對其診斷和治療具有重要價值[1]。肺腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因、多階段、多因素共同作用的結果。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長度大于200 nt的RNA，不編碼蛋白質，可在不同水平對染色質修飾、轉錄和轉錄后水平的基因表達發(fā)揮調控作用。研究發(fā)現多種lncRNA在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。近年研究發(fā)現，lncRNA DGCR5在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，在肝細胞癌、胰腺導管癌等惡性腫瘤中表達降低[3，4]；在肺腺癌中，DGCR5表達升高，對肺腺癌的診斷和預后評價具有重要價值，但其對肺腺癌增殖、侵襲及遷移的作用機制尚不明確[5]。惡性腫瘤細胞的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在細胞侵襲和遷移中具有重要作用，可增加惡性腫瘤細胞的侵襲及遷移能力[6]。Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin) 信號通路在EMT中發(fā)揮重要調控作用[7]。因此本文通過沉默DGCR5觀察其對肺腺癌細胞增殖、侵襲、遷移及Wnt/β-catenin信號通路的影響，探討DGCR5在肺腺癌中的可能作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 人肺腺癌H1650和A549細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.1.2主要試劑 siRNA-DGCR5和陰性對照siRN A購自上海吉瑪公司；qRT-PCR試劑盒、Lipofec-tamineTM轉染試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑、CCK8試劑盒等購自美國Promega公司；Transwell小室購自美國Corning公司；兔抗人E-cadherin多克隆抗體、兔抗人Vimentin多克隆抗體、兔抗人β-catenin多克隆抗體、兔抗人p-gsk-3β多克隆抗體購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細胞分組與轉染 將生長良好的H1650和A549細胞株接種于6孔板(5×105個/孔)，根據隨機數字法分為空白對照組(Blank)、陰性對照組(NC)和siRNA-DGCR5組(si-DGCR5)，待細胞生長至70%以上融合時進行轉染。各組細胞更換無血清培養(yǎng)基，使用脂質體2000、按照說明書進行轉染，si-DGCR5組細胞轉染siRNA-DGCR5，NC組細胞轉染siRNA-NC，Blank組不轉染。轉染6 h后更換培養(yǎng)液，選擇轉染24 h的細胞備用。

1.2.2qRT-PCR測量各組H1650和A549細胞中DGCR5水平 取轉染24 h的各組H1650和A549細胞，TRIzol提取總RNA，取RNA樣品1 μl，測定純度和濃度。將得到的RNA逆轉錄為cDNA，qRT-PCR測量各組H1650和A549細胞中DGCR5水平，PCR反應條件：95℃ 10 min；95℃ 10 s，60℃ 60 s，共42個循環(huán)。以GAPDH為內參照。H1650和A549細胞中DGCR5水平以2-ΔΔCt計算。

1.2.3CCK8測定各組H1650和A549細胞增殖 收集貼壁生長的H1650和A549細胞，調整細胞濃度為5×104個/ml，加入96孔板培養(yǎng)24 h，各組細胞進行相應轉染，轉染方法參照1.2.1，每組設7個復孔，分別在24、48、72 h向各孔中加入CCK8溶液10 μl，孵育2 h，用酶標儀測定各組波長450 nm處OD值。

1.2.4Transwell測定各組H1650和A549細胞侵襲能力 將Matrigel基質膠融化成液態(tài)，在Trans-well小室上室加入基質膠孵育30 min，將轉染后 24 h 的H1650和A549細胞濃度調整為5×105個/ml，上室加入200 μl細胞懸液，下室加入培養(yǎng)液，每組設7個復孔，培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽擦去未穿透細胞，加入多聚甲醛固定20 min，加入結晶紫染色20 min，顯微鏡下拍照觀察每個高倍視野侵襲細胞數。

1.2.5劃痕實驗測定各組H1650和A549細胞遷移能力 取轉染24 h各組H1650和A549細胞接種于6孔板，3×105個/孔，待細胞貼壁生長后更換培養(yǎng)基，用10 μl槍頭垂直劃4條平行線，每組設7個復孔，培養(yǎng)24 h，分別在0 h和24 h拍照，觀察各組細胞遷移情況，測量各組細胞遷移距離。

1.2.6Western blot測定各組H1650和A549細胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平 取各組轉染24 h的H1650和A549細胞，加入細胞裂解液裂解細胞后,以12 000 r/min離心15 min，取上清液以相同條件再次離心15 min，BCA法測定上清液中蛋白濃度。制備電泳凝膠，經電泳、轉膜、封閉，加入一抗：兔抗人E-cadherin多克隆抗體(1∶300)、兔抗人Vimentin多克隆抗體(1∶300)、兔抗人β-catenin多克隆抗體(1∶300)、兔抗人p-gsk-3β多克隆抗體(1∶300)過夜孵育，以β-actin為內參，加入二抗(1∶3 000)孵育2 h，加入ECL發(fā)光液，于暗室曝光、顯影液中顯影、定影液中定影，采用Quantity One軟件分析條帶亮度，H1650和A549細胞中E-cadherin、Vimentin、β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平以其蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值表示。

2 結果

2.1沉默DGCR5對H1650和A549細胞中DGCR5水平的影響 H1650和A549細胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組DGCR5水平降低(P<0.05)；Blank組和NC組DGCR5水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 各組H1650和A549細胞中DGCR5水平比較Tab.1 Comparison of DGCR5 levels in H1650 and A549 cells of each

2.2沉默DGCR5對H1650和A549細胞增殖的影響 H1650和A549細胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組OD值降低(P<0.05)；Blank組和NC組OD值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2、3。

表2 各組H1650細胞OD值比較Tab.2 Comparison of OD values of H1650 cells in each

2.3沉默DGCR5對H1650和A549細胞侵襲能力的影響 H1650和A549細胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組穿膜細胞數降低(P<0.05)；Blank組和NC組穿膜細胞數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表4、圖1。

圖1 Transwell檢測各組H1650和A549細胞侵襲能力(×400)Fig.1 Transwell to detect invasiveness of H1650 and A549 cells in each group (×400)

表4 各組H1650和A549細胞中穿膜細胞數比較Tab.4 Comparison of number of transmembrane cells of H1650 and A549 cells in each

2.4沉默DGCR5對H1650和A549細胞遷移能力的影響 H1650和A549細胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組遷移距離縮短(P<0.05)；Blank組和NC組遷移距離差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5、圖2。

圖2 劃痕實驗測定各組H1650和A549細胞遷移能力 (×100)Fig.2 Scratch test to determine migration ability of H1650 and A549 cells in each group (×100)Note:A.H1650；B.A549.

表5 各組H1650和A549細胞遷移距離比較Tab.5 Comparison of migration distance of H1650 and A549 cells in each

2.5沉默DGCR5對H1650和A549細胞E-cadhe-rin、Vimentin蛋白水平的影響 H1650和A549細胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組E-cadherin蛋白水平升高(P<0.05)，Vimentin蛋白水平降低(P<0.05)；Blank組和NC組E-cadherin、Vimentin蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 各組H1650和A549細胞E-cadherin、Vimentin蛋白表達Fig.3 Expressions of E-cadherin and Vimentin proteins of H1650 and A549 cells in each groupNote:A.H1650;B.A549.1.Blank group;2.NC group;3.si-DGCR5 group.Compared with Blank group, *.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05.

2.6沉默DGCR5對H1650和A549細胞β-cate-nin、p-gsk-3β蛋白水平的影響 H1650和A549細胞中，與Blank組和NC組相比，si-DGCR5組β-catenin蛋白水平降低(P<0.05)，p-gsk-3β蛋白水平升高(P<0.05)；Blank組和NC組β-catenin、p-gsk-3β蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖4。

表3 各組A549細胞OD值比較Tab.3 Comparison of OD values of A549 cells in each

圖4 各組H1650和A549細胞β-catenin、p-gsk-3β蛋白表達Fig.4 Expressions of β-catenin and p-gsk-3β proteins of H1650 and A549 cells in each groupNote:A.H1650;B.A549.1.Blank group;2.NC group;3.si-DGCR5 group.Compared with Blank group, *.P<0.05；compared with NC group,#.P<0.05.

3 討論

肺癌在全球范圍內發(fā)病率和死亡率居高不下，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌的80%，且其5年生存率較低。NSCLC死亡的主要原因為早期臨床癥狀不明顯，臨床確診時通常已進入晚期階段，癌細胞已發(fā)生侵襲和轉移。肺腺癌為NSCLC的一種，治療方法包括手術治療、放療、化療、靶向治療等，但上述治療方法對于發(fā)生侵襲和轉移的肺腺癌患者效果欠佳，預后較差[8]。因此探討肺腺癌的發(fā)病機制，盡早抑制肺腺癌的增殖、侵襲和轉移具有重要意義。

lncRNA是一類由于缺乏開放式閱讀框而導致缺乏蛋白編碼能力的RNA，可通過對基因的表達和翻譯參與調控惡性腫瘤的生物學功能，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲遷移及放化療抵抗等過程中發(fā)揮重要作用[9]。研究已發(fā)現多種lncRNA在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[10]。DGCR5作為一種lncRNA在多種惡性腫瘤中異常表達[11]。DGCR5在乳頭狀甲狀腺癌、膀胱癌、肝癌等惡性腫瘤中表達降低，上調DGCR5可抑制上述惡性腫瘤的進展[12-14]。DGCR5在肺癌中也存在異常表達，Chen等[15]和Luo等[16]研究發(fā)現DGCR5在肺癌組織中表達降低，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮抑癌作用；Dong等[17]和李楠等[18]研究發(fā)現肺腺癌組織中DGCR5呈高表達，對肺腺癌的診斷和預后評價具有重要意義，在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用。本文通過沉默DGCR5觀察其對肺腺癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響，發(fā)現沉默DGCR5可抑制肺腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，本研究結果表明DGCR5在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮促癌作用，抑制肺腺癌細胞中DGCR5表達可抑制肺腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移，DGCR5有望成為肺腺癌的潛在治療靶點。本研究結果與Dong等[17]和李楠等[18]研究結果一致，與Chen等[15]和Luo等[16]研究結果不一致，考慮其原因可能為本研究及Dong等和李楠等的研究對象為肺腺癌，而Chen等和Luo等的研究對象為肺癌，提示DGCR5在不同的肺癌類型中所發(fā)揮的作用可能不完全相同。

研究表明DGCR5參與肺癌的發(fā)生發(fā)展，但其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的機制尚不明確。遠處轉移和浸潤性是癌細胞的重要生物學特性，多數肺腺癌患者并非死于肺腺癌本身，而是隨之出現的轉移。EMT在肺腺癌的侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用，EMT是上皮細胞通過特定程序轉化成具有間質表型細胞的一種生物學過程，E-cadherin表達下降和Vimentin表達升高為EMT的主要特征。EMT后上皮細胞失去原細胞極性和基底膜連接等上皮細胞表型，獲得高遷移和侵襲能力[19，20]。因此EMT是上皮來源細胞遷移和侵襲能力增強的重要原因。本研究發(fā)現沉默DGCR5可升高E-cadherin蛋白水平，降低Vimentin蛋白水平。提示下調DGCR5可能通過抑制肺腺癌細胞EMT發(fā)揮抑制肺腺癌侵襲遷移能力。

Wnt/β-catenin信號通路是經典的Wnt通路，和胚胎發(fā)育及細胞的生長、分化、凋亡等關系密切，還與EMT相關，Wnt/β-catenin信號通路可降低E-cadherin表達，使上皮細胞連接和極性缺失，導致細胞發(fā)生EMT，從而促進細胞的遷移和侵襲[21]。當Wnt信號通路被激活后，信號傳導至p-gsk-3β，使降解復合物失活，導致細胞中β-catenin不能被降解，從而使β-catenin水平升高，p-gsk-3β水平降低[22]。DGCR5在惡性腫瘤中可通過信號通路發(fā)揮作用，如Liu等[23]研究發(fā)現DGCR5可通過激活Wnt信號傳導影響宮頸癌的增殖、遷移和侵襲；Wang等[24]研究發(fā)現DGCR5可通過Wnt信號傳導途徑影響肝細胞癌進展。因此推測DGCR5可能通過Wnt/β-catenin信號通路影響肺腺癌的增殖、侵襲和遷移，故本文對其進行研究，發(fā)現下調DGCR5后，H1650和A549細胞中β-catenin蛋白水平降低，p-gsk-3β蛋白水平升高。表明DGCR5可能通過Wnt/β-catenin信號通路參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，下調DGCR5可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路及肺腺癌細胞EMT抑制肺腺癌的增殖、侵襲和遷移。DGCR5有望成為肺腺癌新的治療靶點。