王志豪 龍 婷 陳 秀 李作孝

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，瀘州 646000)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚未明確，可能與病毒感染、遺傳因素、環(huán)境因素、自身免疫因素等有關(guān)，而腸道微生態(tài)改變可能就是其中一個(gè)重要的環(huán)境因素。腸道菌群作為腸道微生態(tài)的核心組成部分，可通過微生物-腸-腦軸調(diào)控中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育與功能，同時(shí)在疾病進(jìn)展中發(fā)揮致病和保護(hù)作用。腸道菌群參與機(jī)體多種生理生化過程，如免疫、營(yíng)養(yǎng)、神經(jīng)內(nèi)分泌等。菌群的更替、紊亂與腸道慢性炎癥性疾病、MS、帕金森病、抑郁癥、焦慮癥、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[1，2]。Jangi等[3]研究發(fā)現(xiàn)MS患者腸道微生物種屬組成、菌群生物多樣性均與健康人存在差異。Cekanaviciute等[4]也發(fā)現(xiàn)用MS衍生的糞便定植的無菌小鼠具有更嚴(yán)重的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)癥狀。雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片作為益生菌代表，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、維持腸道微生態(tài)穩(wěn)定的作用，能抑制腸道致病菌，改善腸道功能紊亂。研究表明益生菌對(duì)帕金森病、阿爾茨海默病、腦血管病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有一定治療作用[5]。EAE模型是目前研究MS最經(jīng)典的動(dòng)物模型，因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究EAE小鼠腸道菌群的變化，通過益生菌干預(yù)改變EAE小鼠腸道菌群，觀察其對(duì)EAE小鼠的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 30只SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠(6～8周齡，18～22 g)購(gòu)于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：[SCXK(京)2016-0002]，飼養(yǎng)于西南醫(yī)科大學(xué)忠山校區(qū)SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)，自由攝入普通飼料及飲用無菌蒸餾水，飼養(yǎng)室溫(24±2)℃，每12 h明暗交替1次，實(shí)驗(yàn)過程符合《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用條例》。

1.1.2益生菌及主要試劑 雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)公司，批號(hào)：S19980004)；MOG35-55多肽(上海吉爾生化有限公司)；完全弗氏佐劑、百日咳毒素、ELISA試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；卡介苗凍干粉 (上海瑞楚生物科技有限公司)；luxol fast blue(LFB)染液試劑盒、兔抗TLR4、NF-κBp65抗體、山羊抗兔二抗(Aspen公司)；雙歧桿菌培養(yǎng)基、乳桿菌選擇培養(yǎng)基、腸球菌培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司)；梭菌培養(yǎng)基、擬桿菌培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)有限公司)；腸桿菌培養(yǎng)基、消化鏈球菌培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司)；真桿菌培養(yǎng)基(卡邁舒上海生物科技有限公司)；酵母菌培養(yǎng)基(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)；引物設(shè)計(jì)合成(武漢金開瑞生物工程有限公司)；RT-PCR試劑盒(ELK Biotechnology公司)。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備、分組及益生菌干預(yù)方法 將30只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、EAE模型組、益生菌組，造模前各組小鼠均禁食、禁飲24 h，將MOG35-55溶于PBS，稀釋至3 mg/ml，卡介苗溶于完全弗氏佐劑，濃度為10 g/L。將上述2種液體1∶1 混勻至乳化劑。用1 ml注射器分別在EAE模型組、益生菌組小鼠背部皮下注射誘導(dǎo)乳化劑0.2 ml(脊柱兩側(cè)任選4點(diǎn)各0.05 ml)制作EAE模型，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。在造模當(dāng)天及2 d后，造模小鼠均腹腔注射0.5 ml百日咳菌稀釋液，正常對(duì)照組注射等量生理鹽水。益生菌組從造模次日開始以0.4 ml/d的益生菌溶液灌胃，正常對(duì)照組、EAE模型組每天灌胃給予等量生理鹽水，發(fā)病高峰期(神經(jīng)功能評(píng)分連續(xù)3 d無變化為高峰期)處死EAE模型組、益生菌組小鼠，正常對(duì)照組小鼠觀察至第28天處死，取糞便、腦組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2小鼠發(fā)病情況觀察 造模當(dāng)日起每天早8∶00 觀察并記錄小鼠體質(zhì)量變化、毛發(fā)光澤情況，并根據(jù)Kono5分評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。評(píng)分細(xì)則如下：0分為不發(fā)??；1分為尾巴無力；2分為輕微后肢無力；3分為嚴(yán)重后肢麻痹；4分為四肢麻痹；5分為瀕死或死亡。

1.2.3LFB染色 取腦組織側(cè)腦室周圍組織常規(guī)石蠟切片，片厚6 μm，將石蠟切片脫蠟，放入95%乙醇中醇化5 min，然后放入LFB染液中60℃水浴24 h，醇化、分化、鏡檢、封片。

1.2.4腸道菌群檢測(cè) 分別采集3組小鼠發(fā)病高峰期的新鮮糞便樣本10 g，快速置于糞便厭氧裝置，-80℃凍存。檢測(cè)時(shí)取0.5 g糞便標(biāo)本，用肉湯10倍梯度稀釋(1×10-7～1×10-2) 。取20 μl菌液滴種于腸桿菌、腸球菌、葡萄球菌、酵母菌、擬桿菌、雙歧桿菌、消化鏈球菌、乳酸桿菌、真桿菌及梭菌的選擇性培養(yǎng)基。前4種為需氧菌，置于37℃普通培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，其余為厭氧菌，置于厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。采用日本光岡腸道菌群分析法進(jìn)行定性定量檢測(cè)，以API生化鑒定系統(tǒng)的厭氧菌三級(jí)鑒定法鑒定菌種，鑒定細(xì)菌至屬水平，觀察結(jié)果并計(jì)數(shù)，以每g濕糞的菌落形成單位(colony forming unit，CFU) 的對(duì)數(shù)值表示。B/E值為雙歧桿菌與大腸桿菌數(shù)量的比值，用來反映腸道的功能狀況。B/E值>1表示腸道定植抗力正常；B/E值<1表示腸道定植抗力降低，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。

1.2.5ELISA檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)各指標(biāo)水平，按說明書進(jìn)行操作。

1.2.6免疫組織化學(xué)法(IHC)檢測(cè)NF-κBp65核表達(dá) 腦組織切片脫蠟至水，置于EDTA緩沖液中微波加熱行抗原修復(fù)，3%H2O2溶液室溫孵育10 min(以清除內(nèi)源性過氧化物酶活性)，5% BSA封閉 20 min 后滴加稀釋的一抗(1∶50)4℃過夜，滴加二抗(1∶1 000)37℃孵育50 min，PBS液漂洗，DAB顯色，脫水透明封片。在光鏡下放大100倍攝取圖像，輸入圖像分析系Image Pro Plus6.0內(nèi)對(duì)圖像進(jìn)行灰度變換，使染色陽性區(qū)域與背景明顯分開，自動(dòng)測(cè)量陽性面積、積分光密度，并計(jì)算平均光密度值，進(jìn)行半定量分析處理，取其均值為光密度值，表示NF-κBp65的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7RT-PCR檢測(cè)TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá) 采用TRIpure法提取各組小鼠腦組織RNA并行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)M-MLVReverse Transcriptas試劑盒說明書操作得到cDNA模板，利用QuFast SYBR Green PCR Master Mix熒光染料PCR擴(kuò)增R-MBP的基因片段。PCR擴(kuò)增引物序列，TLR4 F：5′-ACACTTTATTCAGAGCCGTTGGT-3′,R:5′-CAGGTCCAAGTTGCCGTTTC-3′,NF-κBp65 F:5′-ACTATGAGGCTGACCTCTGCC-3′,R:5′-TCTGGATTCGCTGGCTA-

ATG-3′,內(nèi)參M-GAPDH F:5′-TGAAGGGTGGAGCCAAAAG-3′，R:5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s，95℃ 5 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s， 40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)液為：2×Master Mix 5.0 μl，引物工作液(2.5 μmol/L) 1.0 μl，上、下游引物各1.0 μl，ddH2O 2.0 μl，Rox 1.0 μl。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量，ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

1.2.8Western blot檢測(cè)TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá) 向各組小鼠腦組織加入裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，除去封閉液，加入用稀釋液稀釋好的一抗4℃孵育過夜?；厥找严♂尩囊豢?，TBST清洗3次，每次5 min，加入二抗稀釋液，室溫孵育 30 min，TBST在室溫下?lián)u床上清洗4次，每次5 min，滴加新鮮配制的ECL 混合溶液到膜的蛋白面，暗室中曝光，根據(jù)不同的光強(qiáng)度調(diào)整曝光條件，顯影、定影，采用AlphaEaseFC軟件處理系統(tǒng)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠一般情況及神經(jīng)功能缺損評(píng)價(jià) 正常對(duì)照組小鼠均未發(fā)病。EAE模型組小鼠造模成功后精神萎靡、毛發(fā)光澤度降低、脫毛、食欲下降、體質(zhì)量減輕，癥狀逐漸加重，出現(xiàn)尾部下垂、步態(tài)不穩(wěn)、后肢行走無力甚至癱瘓。益生菌組小鼠也表現(xiàn)出與EAE模型組小鼠同樣的癥狀，但較EAE模型組癥狀輕。益生菌組小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期較EAE模型組均有延長(zhǎng)，神經(jīng)功能評(píng)分較EAE模型組降低(P<0.05)。各組小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期及高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分結(jié)果，見表1、圖1。

圖1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of changes in neurological defi-cit scores

表1 兩組發(fā)病潛伏期、高峰期、高峰期神經(jīng)功能障礙評(píng)分比較Tab.1 Comparison of latent period，peak period and neuro-functional deficiency scores in two groups

2.2各組小鼠腦組織病理變化 正常對(duì)照組小鼠腦組織LFB染色髓鞘結(jié)構(gòu)清晰。EAE模型組、益生菌組小鼠均出現(xiàn)不同程度的脫髓鞘，髓鞘結(jié)構(gòu)排列稀疏、紊亂，可見不同程度的低染區(qū)域及空泡狀結(jié)構(gòu)，益生菌組上述變化較EAE模型組輕。見圖2。

圖2 各組小鼠腦組織LFB染色情況(×200)Fig.2 Demyelization in brain tissues of mice in different groups by LFB staining(×200)Note:A.Normal control group;B.EAE model group;C.Probiotic group.

2.3各組小鼠腸道菌群變化 在培養(yǎng)的10種腸道主要細(xì)菌中，EAE模型組與正常對(duì)照組相比，擬桿菌數(shù)量減少(P<0.05)。益生菌組與EAE模型組相比，雙歧桿菌、乳桿菌數(shù)量增加(P<0.05)。益生菌組與EAE模型組相比，B/E值上升(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠腸道菌群值和B/E值比較濕糞)Tab.2 Comparison of intestinal flora value and B/E value of mice in each CFU/g wet feces)

2.4各組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)情況 EAE模型組與正常對(duì)照組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)上升(P<0.05)，益生菌組和EAE模型組相比，IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠腦組織IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較Tab.3 Comparison of IL-1β，IL-6，TNF-α contents in brain tissue of each group of

2.5各組小鼠NF-κBp65核表達(dá)情況 EAE模型組(69.09±3.23)和正常對(duì)照組(20.41±1.47)相比，NF-κBp65核表達(dá)上升(P<0.05)；益生菌組(52.69±1.96)與EAE模型組相比，NF-κBp65核表達(dá)降低(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組小鼠腦組織NF-κBp65細(xì)胞核表達(dá)的IHC檢測(cè)結(jié)果(×200)Fig.3 IHC results of nuclear expression of NF-κBp65 cells in brain tissue of mice in each group(×200)Note:A.Normal control group;B.EAE model group;C.Probiotic group.

2.6各組小鼠TLR4、NF-κBp65 mRNA表達(dá)情況 EAE模型組與正常對(duì)照組相比，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá)上升(P<0.05)；益生菌組與EAE模型組相比，TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠TLR4和NF-κBp65 mRNA表達(dá)Tab.4 Expressions of TLR4 and NF-κBp65 mRNA in each groups of

2.7各組小鼠TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)情況 EAE模型組與正常對(duì)照組相比，TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)上升(P<0.05)；益生菌組與EAE模型組相比，TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)降低(P<0.05)。見表5、圖4。

表5 各組小鼠TLR4和NF-κBp65蛋白表達(dá)Tab.5 Expressions of TLR4 and NF-κBp65 proteins in each group of

圖4 Western blot檢測(cè)各組小鼠腦組織蛋白表達(dá)Fig.4 Western blot analysis of brain tissue protein expre-ssions in each group of miceNote:1.Normal control group;2.EAE model group;3.Probiotic group.

3 討論

腸道微生態(tài)是人體最大且最復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，其核心部分是腸道菌群，在漫長(zhǎng)的協(xié)同進(jìn)化過程中，腸道菌群與宿主形成了緊密的共生關(guān)系。腸道菌群與中樞神經(jīng)系統(tǒng)密切相關(guān)，并對(duì)腸道的功能調(diào)節(jié)和穩(wěn)態(tài)維持起重要作用。鑒于腸道微生物群和宿主的復(fù)雜關(guān)系，近年來提出了一種新的理念，即微生物-腦-腸軸，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)、自主神經(jīng)和腸神經(jīng)系統(tǒng)共同形成神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，可局部調(diào)控、整合和處理信息[6]。越來越多的研究證明腸道微生物群和宿主的共生相互作用能誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展，如MS和EAE[7]。MS是一種自身免疫性疾病，其自身免疫起源尚不清楚，誘發(fā)炎癥因素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或外周亦不明確，Oksenberg等[8]研究表明，在單卵雙胞胎中，MS占25%，遺傳和環(huán)境因素都可能導(dǎo)致該病發(fā)生，而腸道菌群就是其中1個(gè)不可忽略的環(huán)境因素。

本研究表明，EAE模型組的擬桿菌含量明顯低于正常對(duì)照組，這與Jangi等[3]采用16S基因測(cè)序法研究MS患者腸道菌群變化結(jié)果基本一致。擬桿菌正常寄居于人和動(dòng)物的腸道、上呼吸道和生殖道，長(zhǎng)期應(yīng)用廣譜抗生素、激素、免疫抑制劑等均可導(dǎo)致腸道菌群失調(diào)或免疫功能紊亂，從而引發(fā)內(nèi)源性感染[9]。EAE模型組B/E<1表明EAE小鼠腸道菌群平衡失調(diào)，腸道定植能力下降。腸道菌群紊亂可破壞腸道屏障，增加其通透性，使各種細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物易于透過腸道屏障作用于全身，參與多種疾病的發(fā)病及病理生理過程；而腸道定植能力是機(jī)體免疫的重要組成部分，其水平下降可增加腸道感染風(fēng)險(xiǎn)。Riccio等[10]研究表明，飲食可以影響復(fù)發(fā)-緩解型和原發(fā)性MS的嚴(yán)重程度，高鹽、動(dòng)物脂肪、紅肉、碳水化合物可能會(huì)加重癥狀，蔬菜、水果、益生元和益生菌可通過保持健康的腸道菌群以減輕癥狀。由此說明通過改變共生腸道菌群的組成、數(shù)量、結(jié)構(gòu)可能影響MS的病程[11]。雙歧桿菌、乳桿菌是腸道微生物中最重要的益生菌，對(duì)維持腸道菌群平衡發(fā)揮重要作用，雙歧桿菌是一種生理性有益菌，具有抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、改善胃腸道功能等多種重要的生理功能[12]。其可在腸黏膜表面形成生物學(xué)屏障、機(jī)械屏障，可降低腸道pH值，此外還可減少腸道內(nèi)有害物質(zhì)如過氧化氫、羥基苯等的產(chǎn)生[13，14]。乳桿菌可降低腸道pH值，為有益菌群提供適宜的生存環(huán)境，并能抑制潛在致病菌的生長(zhǎng)，有助于維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定；同時(shí)能恢復(fù)細(xì)胞因子，維持細(xì)胞因子平衡[15]；此外，乳桿菌還可減少腸道中炎癥介質(zhì)的釋放，調(diào)節(jié)腸道免疫功能，進(jìn)而減輕腸道炎癥反應(yīng)[16]。提示益生菌可抑制腸道內(nèi)源性及外源性潛在致病菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附和定植；同時(shí)，益生菌還能通過爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)、調(diào)節(jié)腸道pH值、產(chǎn)生具有廣譜抗菌作用的物質(zhì)等多種生物拮抗功能，對(duì)腸道內(nèi)致病菌起抑菌或殺菌作用，對(duì)維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)腸道功能至關(guān)重要[17]。本研究結(jié)果顯示，益生菌組小鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌、B/E值明顯高于EAE模型組，表明益生菌能有效改善EAE小鼠腸道微生態(tài)環(huán)境，提高腸道定植抗力。

Varga等[18]和Garcia等[19]研究表明腸道中有害菌群產(chǎn)生的毒素能被腸道吸收進(jìn)入血流，引起MS樣癥狀，這些毒素可與受體結(jié)合后存在于大腦的血管系統(tǒng)和有髓鞘、無髓鞘的腦組織區(qū)域[20]。過量的腸道細(xì)菌及其產(chǎn)物可通過腸道黏膜屏障進(jìn)入腸系膜淋巴結(jié)、血液或其他腸外臟器，并能透過血腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過一系列的炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡與氧化損傷，最終導(dǎo)致腦損傷[21-23]。TLR4/NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)鍵途徑。TLR4是細(xì)菌LPS的受體，能將LPS轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的信號(hào)迅速傳至核內(nèi)，激活位于下游樞紐位置的NF-κB，活化的NF-κB入細(xì)胞核促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的合成和釋放。既往研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達(dá)水平在EAE的整個(gè)疾病進(jìn)程中始終呈持續(xù)升高狀態(tài)[24]。本研究也顯示EAE模型組TLR4和NF-κBp65在mRNA和蛋白水平上表達(dá)均顯著升高，NF-κBp65核表達(dá)增加，NF-κB下游炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量增加，提示TLR4/NF-κB信號(hào)通路的激活可能參與EAE的發(fā)病過程。抑制TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對(duì)NF-кB的激活、對(duì)疾病的發(fā)病、進(jìn)展均有一定抑制作用[25]。本研究顯示，益生菌組小鼠通過益生菌干預(yù)調(diào)節(jié)腸道菌群后，TLR4和NF-κBp65在mRNA和蛋白水平上表達(dá)顯著下調(diào)，NF-κBp65核表達(dá)減少，IL-1β、IL-6、TNF-α含量也明顯減少，提示益生菌可抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路。

益生菌具有調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道穩(wěn)態(tài)作用。益生菌組小鼠發(fā)病潛伏期、高峰期延長(zhǎng)，臨床癥狀輕，神經(jīng)功能評(píng)分降低，腦組織脫髓鞘輕。上述結(jié)果均表明，益生菌調(diào)節(jié)腸道中雙歧桿菌、乳桿菌等有益菌群，提高了腸道定植抗力，可發(fā)揮治療EAE作用，對(duì)改善EAE的臨床癥狀具有一定的治療意義。推測(cè)其作用途徑可能是通過抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制下游炎癥因子釋放的級(jí)聯(lián)效應(yīng)。對(duì)于EAE小鼠腸道菌群的變化及其代謝產(chǎn)物如何調(diào)控TLR4/NF-κB信號(hào)通路，本課題組將于后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。