陳敏云 王佳蓉 吳瑞珊

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科，泉州 362000)

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是鼻黏膜接觸吸入性變應(yīng)原后由IgE介導(dǎo)的以嗜酸性粒細(xì)胞為主的鼻黏膜炎癥，為Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)，在亞洲人群中的患病率高達(dá)38%[1]。典型的臨床癥狀為鼻塞、清水樣鼻涕、陣發(fā)性噴嚏、鼻癢等[2,3]。部分AR患者可合并哮喘、慢性咳嗽等下氣道疾病。鼻淵通竅顆粒是臨床中常用的鼻部藥物，疏風(fēng)清熱，宣肺通竅，常用于急鼻淵(急性鼻竇炎)屬外邪犯肺證[4]。目前關(guān)于其對(duì)AR的作用機(jī)制尚不明確，因此本研究旨在探討鼻淵通竅顆粒緩解AR的作用及相關(guān)信號(hào)通路，以期為其更科學(xué)的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2～3周齡SPF級(jí)SD大鼠45只，體質(zhì)量(150±20)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(閩)2015-0001，單位使用許可證編號(hào)：SYXK(閩)2015-0023。

1.1.2主要試劑 表面活性蛋白(surfactant protein A(SP-A)抗體、TLR4抗體、NF-κB p65抗體購于上海順博生物工程有限公司；抗原修復(fù)試劑盒及ELISA試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；鼻淵通竅顆粒購于山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字Z20030071)。

1.2方法

1.2.1模型構(gòu)建及分組 45只大鼠隨機(jī)均分為對(duì)照組、AR模型組、鼻淵通竅顆粒治療組，分別采用不同的處理方法。AR模型組：模型構(gòu)建分為基礎(chǔ)致敏階段及局部激發(fā)階段。基礎(chǔ)致敏階段：將 OVA 0.3 mg、Al(OH)330 mg、生理鹽水1 ml混合制成混懸液，腹腔內(nèi)注射，隔1 d注射1次，共注射7次。局部激發(fā)階段：第一階段完成后，以2% OVA滴鼻，每側(cè)鼻腔50 μl，1次/d，共進(jìn)行7次。對(duì)照組：正常飼養(yǎng)，以等量生理鹽水替代OVA，其余操作同模型組。治療組：模型構(gòu)建方法同模型組，同時(shí)以鼻淵通竅顆粒溶液滴鼻，每側(cè)鼻腔 50 μl，1次/d，共15次。

1.2.2HE染色 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠并切下頭部，取出上頜骨，固定于4%多聚甲醛溶液，將鼻中隔軟骨連同其表面黏膜一同取下。浸泡于10%EDTA 脫鈣液，連續(xù)7 d，每天更換脫鈣液。常規(guī)石蠟包埋、切片、烤片，冷卻后低溫凍存。經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化。蘇木素染色30～60 s，沖洗5 min，伊紅染色30 s，沖洗5 min；乙醇梯度脫水，干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，晾干，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.3免疫組化染色 頸動(dòng)脈組織經(jīng)甲醛固定后，石蠟包埋、切片。對(duì)組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟、水化，H2O2去離子水孵育。高溫修復(fù)抗原，PBS沖洗，滴加100 μl鼠抗人SP-A單克隆抗體(1∶1 000),4℃冰箱孵育過夜。PBS沖洗3次,每次2 min。滴加二抗，37℃孵育20～30 min。PBS沖洗3次,每次2 min。DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。以出現(xiàn)棕色顆粒為SP-A陽性標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4Western blot檢測(cè) 收集各組大鼠鼻黏膜組織，提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。混合上樣緩沖液，煮沸變性，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗二抗孵育、ECL法顯影定影。Quantity One軟件分析條帶，以β-actin為內(nèi)參，檢測(cè)TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)。

1.2.5ELISA檢測(cè) 將獲取的每組大鼠肺泡灌洗液，使用IgE、ECP、OVA-sIgE、IL-1β、IL-18、IL-17、IFN-γ、TGF-β1 ELISA 試劑盒測(cè)定各組細(xì)胞因子的濃度,按照說明書操作。 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組細(xì)胞因子濃度。

1.2.6流式細(xì)胞檢測(cè) 于大鼠脾臟處剪開小口，用彎頭小鑷夾出脾臟。放入裝滿1640培養(yǎng)液的1.5 ml EP管中，置于冰上待用，研磨后得到初步的脾細(xì)胞懸液。300 g離心5 min，棄上清，以流式染色緩沖液重懸細(xì)胞提純脾細(xì)胞懸液，PBS 清洗2次，將細(xì)胞稀釋至1×107個(gè)/ml，分別取100 μl細(xì)胞懸液到對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)孔中，加入1 ml刺激液，4 h后，離心7 min，胞外染色、破膜，胞內(nèi)染色，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠的體質(zhì)量變化 在實(shí)驗(yàn)的第1天、第22天(給藥前)，3組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。36 d給藥結(jié)束時(shí)，模型組大鼠體質(zhì)量顯著低于對(duì)照組及治療組(P<0.05)，但對(duì)照組及治療組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化Tab.1 Weight changes of rats in each

2.2各組大鼠癥狀比較 模型組及治療組大鼠在末次鼻腔刺激后均出現(xiàn)明顯的刺激癥狀，包括打噴嚏、搔鼻、易怒、易激惹等。對(duì)照組及模型組大鼠在治療前后癥狀評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而治療組大鼠癥狀評(píng)分顯著降低(P<0.05)。兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的噴嚏次數(shù)及抓鼻次數(shù)顯著增加，治療組次之，對(duì)照組最少，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠癥狀比較Tab.2 Comparison of symptoms of rats in each

2.3各組大鼠鼻黏膜組織HE染色 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠鼻黏膜上皮及間質(zhì)結(jié)構(gòu)正常，無明顯病變。模型組大鼠部分鼻黏膜上皮脫落，腺體增生，組織水腫，伴有明顯嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組大鼠的鼻黏膜仍存在較為明顯的上皮病變、腺體增生，但與模型組相比，杯狀細(xì)胞增生及炎癥反應(yīng)均有所減輕(圖1)。

圖1 各組大鼠鼻黏膜組織HE染色Fig.1 HE staining in nasal mucosa of rats in each group

2.4各組大鼠鼻黏膜SP-A的免疫組化檢測(cè) 免疫組化結(jié)果表明，SP-A主要定位于細(xì)胞質(zhì)。與對(duì)照組相比，模型組及治療組大鼠鼻黏膜中陽性表達(dá)率明顯升高，染色程度更深。Image J軟件分析結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組、治療組的SP-A平均灰度值分別為80.46±6.74、110.95±8.32、102.47±7.77，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組大鼠鼻黏膜組織中SP-A染色(×400)Fig.2 SP-A staining in nasal mucosa of rats in each group(×400)

2.5各組大鼠血清相關(guān)指標(biāo)比較 ELISA結(jié)果顯示，與模型組相比，對(duì)照組大鼠血清IgE、ECP、OVA-sIgE、IL-1β、IL-18、IL-17水平明顯升高，IFN-γ、TGF-β1水平降低(P<0.05)。而治療組與對(duì)照組的IL-1β、L-18、IL-17水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清相關(guān)指標(biāo)比較Tab.3 Comparison of serum related indexes of rats in each

2.6各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比例 與對(duì)照組相比，模型組及治療組大鼠Th1、T bet+Th1細(xì)胞亞群比例顯著降低(P<0.05)，Th2、Th17細(xì)胞亞群比例顯著升高(P<0.05)。與模型組相比，治療組大鼠Th1、T bet+Th1細(xì)胞亞群比例明顯上升(P<0.05)，Th2、Th17細(xì)胞亞群比例下降(P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群比例Tab.4 Proportion of T-lymphocyte subsets in spleen of rats in each

2.7各組大鼠鼻黏膜NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá) 與對(duì)照組相比，模型組大鼠鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，治療組大鼠鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，治療組與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 大鼠鼻黏膜NF-κB p65和TLR4蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of NF-κB p65 and TLR4 protein in nasal mucosa of ratsNote:A.Compared with Control group,*.P<0.05;B.Compared with Model group,#.P<0.05.

3 討論

AR主要包括以下幾種癥狀：①噴嚏：每天數(shù)次陣發(fā)性發(fā)作，每次多于3個(gè)，多在晨起、夜晚或接觸過敏原后立刻發(fā)作[5，6]；②清涕：大量清水樣鼻涕，時(shí)有不自覺從鼻孔滴下現(xiàn)象[7,8]；③鼻塞：間歇或持續(xù)，單側(cè)或雙側(cè)，輕重程度不一；④鼻癢：多數(shù)患者鼻內(nèi)發(fā)癢，花粉癥患者可伴有眼癢、耳癢和咽癢。

鼻淵通竅顆粒是臨床中治療AR的常用藥物，其主要成分包括辛夷、蒼耳子(炒)、麻黃、白芷、薄荷、藁本、黃芩、連翹、野菊花、天花粉、地黃、丹參、茯苓、甘草等。AR癥見前額或顴骨部壓痛，鼻塞時(shí)作，流涕黏白或黏黃，或頭痛，或發(fā)熱，苔薄黃或白，脈浮等[9]。本研究通過HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠部分鼻黏膜上皮脫落，腺體增生，組織水腫，伴明顯嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。治療組大鼠的鼻黏膜仍存在較為明顯的上皮病變、腺體增生，但與模型組相比，杯狀細(xì)胞增生及炎癥反應(yīng)均有所減輕。提示鼻淵通竅顆粒對(duì)AR大鼠的鼻黏膜有明顯的保護(hù)作用，可有效抑制炎癥反應(yīng)及杯狀細(xì)胞增生。

肺表面活性物質(zhì)蛋白包括表面活性蛋白A、B、C、D 4種[10]。其中，SP-A含量最多，約占50%～70%，參與肺宿主防御。近年來，SP-A在肺外系統(tǒng)中作用的研究越來越多，其可有效抑制變應(yīng)性哮喘病程中的組胺釋放和IgE介導(dǎo)的肥大細(xì)胞脫顆粒，表現(xiàn)出強(qiáng)大的抵御變應(yīng)原的能力[11]。本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組及治療組大鼠鼻黏膜中SP-A陽性表達(dá)率明顯較高，染色程度更深。提示SP-A可能參與AR的炎癥反應(yīng)過程，且其表達(dá)隨著疾病程度加重而升高。

細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌、真菌和病毒的感染可誘導(dǎo)初始T向Th1分化[12]。Th2細(xì)胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-9、IL-10和IL-13[13]。在體外，Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵步驟是在T細(xì)胞活化期間存在外源IL-4而不存在IFN-γ。Th17的大部分效應(yīng)能力來自IL-17和GM-CSF。IL-17與TNF-α一起通過誘導(dǎo)黏附分子、趨化因子、前列腺素E2和基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)促進(jìn)炎癥發(fā)生發(fā)展[14]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，治療組大鼠Th1、T bet+Th1細(xì)胞亞群比例明顯上升，Th2、Th17細(xì)胞亞群比例下降。提示鼻淵通竅顆粒可有效調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17細(xì)胞平衡，緩解炎癥反應(yīng)。TLR4誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活在自身免疫性疾病、超敏反應(yīng)等多種疾病中扮演重要角色。在炎癥反應(yīng)中一旦被激活，即可出發(fā)級(jí)聯(lián)瀑布式反應(yīng)，通過與其他炎癥因子相互作用，加重炎癥反應(yīng)。本研究通過Western blot發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，治療組大鼠鼻黏膜TLR4、NF-κB p65蛋白表達(dá)明顯下降，與對(duì)照組無明顯差異。提示鼻淵通竅顆?？捎行б种芓LR4/NF-κB 信號(hào)通路的激活，這可能是其發(fā)揮臨床效應(yīng)的機(jī)制之一。