王燦 羅茜 羅焱 劉素桃 余音 刁慶春 黎智 李晶

黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)是指原發(fā)于皮膚的惡性黑色素瘤，在皮膚腫瘤的占比約3%，死亡率高達65%，其全球發(fā)病率和死亡率逐年上升[1]。其早期即可發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移和血性轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)移患者對放化療敏感性差，預后極差；目前缺乏療效確切、行之有效的防治方案[2-3]。因此尋找黑色素瘤發(fā)病和轉(zhuǎn)移的生物標志物和靶點具有重要的臨床意義，以期開發(fā)新的治療黑色素瘤的方法。有研究顯示MSX1在肺癌、胃癌、兒童急性T淋巴細胞白血病等腫瘤中異常表達[4-7]，作為抑癌基因參與腫瘤的進展，但在黑色素瘤中尚未見報道。

1 資料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)和材料儀器

人黑色素瘤細胞系HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T、MDA-MB-435s和正常皮膚色素痣細胞FF均購自美國ATCC細胞庫；實驗所用細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(購自美國Gibico公司)在恒溫37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)；一抗及二抗(MSX1，active-β-catenin，c-Myc，Cyclin D1和p21)和二抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG購自美國 Abcam 公司；MSX1引物由華大基因公司設計并合成；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光PCR試劑盒均購自美國生物應力公司；實時熒光定量PCR儀購自ProteinSimple公司；基質(zhì)膠購自Millipo公司。

1.2 臨床組織樣本

選取2011年1月—2017年12月重慶市中醫(yī)院皮膚科治療的黑色素瘤患者的手術樣本和病理資料：包括30例色素痣樣本和50例惡性黑色素瘤樣本(包括腫瘤組織和癌旁正常組織，其中原發(fā)灶45例，轉(zhuǎn)移灶5例)；本研究通過重慶市中醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均簽署知情同意書；所有臨床組織樣本病理檢查均由我院病理科副高及以上職稱醫(yī)師診斷和提供。

1.3 實驗方法

1.3.1 RNA和蛋白提取 黑色素瘤細胞系消化離心，收集上述皮膚惡性黑素瘤、色素痣組織樣本并研磨成粉，取50～100 mg組織樣品，加入1 mL TRIzol 試劑抽提組織樣本中總 RNA[8]。提取后RNA在Landdrop儀器中測得濃度，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，實驗方法及步驟參考樣品實驗說明書及已有的參考文獻[8]。將逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA放于-20℃冰箱中保存。

1.3.2 MSX1過表達載體構建，細胞轉(zhuǎn)染和在線數(shù)據(jù)分析 細胞轉(zhuǎn)染的基礎同已有的文獻報道[9-10]。選取MSX1 mRNA表達量最低A375細胞為研究載體，活性狀態(tài)下的A375種于六孔板，細胞融合度生長至約70%～80% 時進行相應功能實驗。以Lipofectamine-2000(Thermo Fisher Scientific)為載體，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Flag-MSX1質(zhì)粒(實驗組)和pcDNA3.1(+)-Flag-vector(對照組)，轉(zhuǎn)染48h后收集細胞提取RNA并進行細胞功能實驗。通過GEPIA2數(shù)據(jù)庫(http：//gepia.cancer-pku.cn/)分析基因的相對表達與預后的關系(版本號：GEPIA2 2019)；總生存期(Overall survival，OS)指從診斷開始至因任何原因引起死亡的時間。無病生存期(Disease-free survival，DFS)定義為從診斷開始至疾病復發(fā)或(因任何原因)死亡的時間。

1.3.3 qRT-PCR檢測MSX1在黑色素瘤中的表達 實時熒光的相對表達分析PCR擴增程度，以擴增指數(shù)期為起始模板進行半定量分析；擴增指數(shù)越高，mRNA的相對表達越高。實驗組和對照組獨立重復三次。實驗中所用的引物序列：MSX1-F：5′-CTACGCTCCGTGAGATGTGCT-3′，MSX1-R：5′-TAGCACTCAGTATGATAACTA-3′。

1.3.4 免疫組織化學法 免疫組織化學實驗包括[11]：(1)樣本石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS(PH7.4)沖洗三次，每次5 min；(2)對組織抗原進行相應的修復(10 min)；(3)3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育10 min；(4)PBS 沖洗三次，每次5 min；(5)滴加4%羊血清封閉，室溫30 min，以減少非特異性染色；(6)孵一抗和二抗、DAB顯色等。在倒置顯微鏡下隨機五個視野，計算相對光密度。

1.3.5 甲基化PCR檢測MSX1在黑色素瘤中甲基化 甲基化PCR的主要方法包括[12]：(1)收集黑色素瘤樣本，蛋白酶K及RNA酶提取基因組 DNA；(2)分別加入糖苷配糖基，乙酸胺和的冰凍乙醇。-20℃過夜沉淀 DNA；(3)Promega Wizard Cleanup DNA純化回收系統(tǒng)修飾后DNA純化回收；(4)修飾后DNA用于PCR；(5)PCR產(chǎn)物的凝膠回收；(6)PCR產(chǎn)物與T載體的連接和轉(zhuǎn)化、白斑篩選。其中PCR反應體系：95℃變性5 min，95℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s，72℃延伸4 min；總循環(huán)35個循環(huán)。

1.3.6 Transwell實驗檢測遷移和侵襲 遷移實驗[13]：實驗組和對照組細胞消化離心計數(shù)，取濃度為3×103個細胞/mL的RPMI-1640培養(yǎng)液植于Transuell小室，小室底部加入20%濃度胎牛血清1640培養(yǎng)液約700 μL；恒溫孵育箱中培養(yǎng)24 h后取出小室，固定，染色，計數(shù)并評價細胞遷移能力。侵襲實驗：實驗前在Transwell小室中鋪入無血清基質(zhì)膠(無血清RPMI-1640基礎培養(yǎng)液∶基質(zhì)膠=1∶5)，放于恒溫孵育箱中待其凝固后(約4～6 h)，進行侵襲實驗，其余步驟同遷移實驗；所有實驗均重復三次。

1.3.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗 收集實驗組和對照組細胞，使用蛋白裂解液(每1 mL含800 μL T-PER蛋白抽提試劑、100 μL磷酸酶抑制劑和100 μL蛋白酶抑制劑)提取細胞蛋白[12，14]；通過BCA法測定蛋白濃度。50 μg/孔細胞蛋白用10%～12%SDSPAGE凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移PVDF膜。4℃下孵育一抗(1∶100)過夜。第二天，二抗(1∶500)封閉液室溫下?lián)u床孵育2 h，顯色劑(DAB)顯色、成像儀曝光，并用Quantity One軟件分析蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計分析方法

運用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD-t檢驗，MSX1蛋白表達與臨床資料關系、色素痣樣、癌組織和癌旁組織間甲基化率的比較用卡方檢驗進行分析。生存曲線由GEPIA2數(shù)據(jù)庫通過Kaplan-Meier法繪制，組間比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MSX1在人黑色素瘤細胞系和組織中表達

與色素痣細胞FF相比，MSX1 mRNA在黑色素瘤細胞系(HM、A375、WM451、WM35、SK-MEL-1、Hs-695T和MDA-MB-435s)中均表達下調(diào)(圖1A，F(xiàn)=22.12，P<0.001)，而在A375細胞中表達量最低。與色素痣組織相比，MSX1 mRNA表達水平在皮膚黑色素瘤(Cutaneous Malignant melanoma，CMM)組織和轉(zhuǎn)移性黑色素瘤(Metastatic cutaneous melanoma，MCM)中表達下調(diào)，其中MSX1 mRNA在MCM中表達最低(圖1B，P<0.001)。免疫組織化學法發(fā)現(xiàn)，MSX1蛋白在CMM和MCM組織中表達降低，與正常色素痣組織(0.623±0.045)相比，MSX1在CMM和MCM中的光密度(0.421±0.016)、(0.266±0.023)降低(圖1C，P<0.001)，其中MSX1蛋白在MCM中表達最低。GEPIA2在線數(shù)據(jù)進一步分層研究大樣本數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，低表達MSX1與OS和DFS無關(圖1D，P>0.05)。進一步分析發(fā)現(xiàn)，MSX1在CMM和MCM中的表達與性別、年齡、分級分期等基線特征無關(P>0.05)。

圖1 MSX1在黑色素瘤細胞和組織中的表達及與預后的關系Figure 1 The expression of MSX1 in melanoma cells and tissues and its prognosisionNote：A.The expression of MSX1 mRNA was downregulated in CMM cell lines(***P<0.001，when compared with FF)；B.The expression of MSX1 mRNA was down-regulated in CMM and MCM tissues(***P<0.001，when compared with Nevi)；C.The expression of MSX1 protein was down-regulated in CMM and MCM tissues(***P<0.001，when compared with Nevi)(100×)；D.The data from online Gepia showed that the expression of MSX1 was not significantly correlated with OS and DFS.

2.2 MSX1在人黑色素瘤中甲基化表達

分析發(fā)現(xiàn)MSX1啟動子存在CpG島(圖2A)；甲基化PCR(MSP)證實，MSX1啟動子在黑色素瘤患者中甲基化率為92%(46/50例)，明顯高于配對的癌旁組織的46%(23/50例)和正常的色素痣中的6.67%(2/30例)(χ2=57.52，P<0.01)(圖2B)；因此，本研究推測MSX1基因啟動子甲基化可能參與黑色素瘤的進程。

圖2 MSX1在黑色素瘤組織中啟動子甲基化表達Figure 2 The methylation of MSX1 in CMM and Nevi tissuesNote：A.CpG island of MSX1；B.MSP showed the methylation of MSX1 in paired CMM and nevus tissues.

2.3 MSX1過表達表達對人黑色素瘤細胞遷移和侵襲的影響

為驗證MSX1能否作為抑癌基因參與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展，Transwell細胞遷移和侵襲實驗分別檢測轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-Flag-MSX1和pcDNA3.1(+)-Flag-Vector的黑色素瘤細胞A375；結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1(+)-MSX1的實驗組A375細胞穿過小室的細胞顯著低于對照組(圖3，t=13.232，P<0.001；t=21.436，P<0.001)。

2.4 MSX1過表達表達對腫瘤干細胞標志物的影響

本研究通過RT-PCR和qRT-PCR實驗發(fā)現(xiàn)，過表達MSX1后能抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關標志物表達如：E-cadherin(E-cad)升高(t=11.154，P<0.001)，Vimintin(Vim)降低(t=21.486，P<0.001)，N-cadherin(N-cad)降低(t=14.662，P<0.001)和EMT下游相關標志物如：STAT3(t=20.186，P<0.001)和OCT4(t=21.553，P<0.001)等mRNA的表達(圖4A，4B，P<0.001)，因此我們推測MSX1可能通過調(diào)控EMT相關標志物從而影響腫瘤的遷移和侵襲。

2.5 重新表達MSX1對Wnt/β-catenin信號通路的影響

Western blot檢測過表達MSX1后對active-β-catenin及下游靶基因的影響，結(jié)果顯示過表達MSX1后，active-β-catenin(t=7.879，P<0.001)及下游靶基因c-Myc(t=16.612，P<0.001)，Cyclin D1(t=24.324，P<0.001)的表達明顯受到抑制(圖5A，5B，P<0.001)；c-Myc(t=20.166，P<0.001)，Cyclin D1(t=17.544，P<0.001)等mRNA表達水平降低(圖5C，P<0.001)。因此，本研究提示MSX1能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控黑色素瘤的進程。

圖3 MSX1過表達后能抑制黑色素瘤細胞A375遷移和侵襲Figure 3 Overexpression of MSX1 inhibited migration and invasion of A375 cellsNote：(A-B)The migration and invasion capacity of vector-or MSX1 cells，***P<0.001(×200).

圖5 MSX1過表達后對Wnt/β-catenin信號通路的影響Figure 5 Overexpression of MSX1 disrupted the Wnt signaling pathwaysNote：A.Western blot；B.The analysis of protein bands.***P<0.001，when compared with the vector control group；C.The results of qRT-PCR.***P<0.001，when compared with the vector control group.

圖4 MSX1過表達后能抑制黑色素瘤細胞A375上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關標志物表達Figure 4 Overexpression of MSX1 inhibited the EMT expression and its related markersNote：A.RT-PCR showed representative stem cell markers in MSX1-infected A375 cells.*Indicates significantly changed bands；B.qRT-PCR showed representative EMT related markers in MSX1-infected A375 cells.***P<0.001，when compared with the vector control group.

3 討論

腫瘤遷移和侵襲是黑色素瘤治療失敗和癌癥死亡的主要原因之一，尋找早期診斷和治療黑色素瘤遷移和侵襲相關的分子靶點為其治療提供了新的思路。EMT抵制凋亡和血管生成被認為是腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移必經(jīng)的三個步驟[15-16]。DNA甲基化在不同的腫瘤組織中具有相對特異性，抑癌基因啟動子DNA異常甲基化是導致其表達降低或沉默的主要原因之一[17]。在惡性腫瘤細胞中DNA甲基化水平及模式的改變能通過影響染色質(zhì)組的穩(wěn)定性及基因組的表達從而促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[18]，為腫瘤患者的“個性化”治療提供參考。

MSX1基因位于4p16.1染色體上，屬于同源異形盒家族，編碼一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，能與轉(zhuǎn)錄復合體的核心蛋白或者其他同源異形蛋白相互作用，在胚胎的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用；研究顯示MSX1啟動子DNA在肺癌、胃癌、兒童急性T淋巴細胞白血病等腫瘤中存在異常甲基化[4-7]，作為潛在的抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但MSX1在黑色素瘤組織中表達、甲基化、預后、遷移/侵襲、干細胞表達等分層研究目前國內(nèi)外尚無報道。

本研究結(jié)果顯示，MSX1 mRNA在黑色素瘤細胞系和組織的表達下調(diào)，其蛋白在黑色素瘤組織中表達下調(diào)；提示MSX1可能作為腫瘤相關基因參與黑色素瘤的進程。MSP結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，MSX1在黑色素瘤組織樣本中DNA甲基化升高，正常色素痣組織中低甲基化表達。DNA甲基化是惡性腫瘤的重要發(fā)展事件，提示MSX1可能作為黑色素瘤進程的重要甲基化基因影響其癌癥進程和腫瘤發(fā)生；因樣本量過低，尚需更多的樣本量進行進一步的分析其表達與分期、預后等臨床病理特征等聯(lián)系。

EMT能使腫瘤細胞干細胞化，耐藥性增強，降解基底膜和細胞外基質(zhì)，促進血管生成，形成腫瘤微環(huán)境等導致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[19-20]。A375細胞過表達MSX1后細胞遷移和侵襲明顯受到抑制，而MSX1能否調(diào)控EMT尚不清楚。本研究通過功能實驗發(fā)現(xiàn)黑色素瘤細胞A375恢復MSX1基因表達后，細胞遷移和侵襲受到明顯抑制。RT-PCR顯示，過表達MSX1基因后的A375細胞中，EMT相關的標志物如：E-cad升高，Vim和N-cad表達下調(diào)；而其下游的STAT3和OCT4等標志物的mRNA表達下調(diào)。STAT3和OCT4是一組可以被不同的細胞因子或者生長因子激活的轉(zhuǎn)錄因子，其成員具有信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄調(diào)控雙重功能，在接受外界信號刺激后激活并進入核內(nèi)影響基因的轉(zhuǎn)錄[21-22]。而活化的STAT3和OCT4能夠通過多種方式促進腫瘤的進展，如促進腫瘤細胞的增殖、侵襲轉(zhuǎn)移、耐藥、EMT、調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境、促進腫瘤干細胞的更新與分化等；其活化與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移密切相關[22-23]。

Wnt/β-catenin信號通路在多種腫瘤惡性增殖、EMT、血管生成和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用[24]。進一步對MSX1在黑色素瘤細胞中的生物學機制進行初步探索發(fā)現(xiàn)，MSX1能抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導。過表達MSX1后的A375細胞，active-β-catenin及下游的調(diào)控靶點c-Myc，Cyclin D1的表達降低。c-Myc、Cyclin D1和STAT3協(xié)同調(diào)控EMT的表達或腫瘤的進程，其表達上調(diào)提示預后不良[25]。更值得關注的是，Wnt信號通路能夠促進腫瘤細胞發(fā)生EMT，促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移。因此我們推測MSX1通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導抑制黑色素瘤遷移和侵襲。

綜上所述，本研究首次證實了在黑色素瘤組織和細胞系中MSX1表達下調(diào)；MSX1通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路的轉(zhuǎn)導和EMT影響黑色素瘤的進程。有助于我們進一步的了解惡性黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤分子調(diào)控機制，為其早期診斷及靶向治療提供了新的思路和依據(jù)。