孫勝枚，談詠南，鄧悅峰

(李錦記(新會(huì))食品有限公司，廣東 江門 529156)

現(xiàn)今人們的生活條件越來(lái)越好，對(duì)生活品質(zhì)的追求也越來(lái)越高，特別是在食品的選擇上，越來(lái)越注重食品安全問(wèn)題。美食佳肴琳瑯滿目，但美食的背后不可或缺的是萬(wàn)千調(diào)味品，所以調(diào)味品的食品安全問(wèn)題不容忽視，更值得關(guān)注。

砷是GB 2762-2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》中的食品安全項(xiàng)目，包括總砷和無(wú)機(jī)砷。自然界中砷主要以無(wú)機(jī)砷和有機(jī)砷的形式存在，無(wú)機(jī)砷包括亞砷酸鹽As(Ⅲ)和砷酸鹽As(Ⅴ)，有機(jī)砷包括二甲基砷酸DMA、一甲基砷酸MMA、三甲基砷酸TMAO、砷膽堿 AsC和砷甜菜堿AsB[1]。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)將亞砷酸鹽As(Ⅲ)和砷酸鹽As(Ⅴ)列為Ⅰ級(jí)致癌物[2]，其中亞砷酸鹽As(Ⅲ)的毒性大于砷酸鹽As(Ⅴ),而砷酸鹽As(Ⅴ)的毒性又大于有機(jī)砷，可溶性砷毒性大于不溶性砷[3]，而且As(Ⅲ)的毒性約為As(Ⅴ)的60倍[4]。綜上所述，無(wú)機(jī)砷的毒性遠(yuǎn)大于有機(jī)砷。

海產(chǎn)品中砷含量很高，但主要以有機(jī)砷形式存在。同理，海產(chǎn)調(diào)味品中砷含量也很高，因此分離檢測(cè)海產(chǎn)調(diào)味品中無(wú)機(jī)砷的含量，對(duì)評(píng)價(jià)海產(chǎn)調(diào)味品食品安全風(fēng)險(xiǎn)有重大意義。目前對(duì)于無(wú)機(jī)砷檢測(cè)方法的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法有GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》和GB/T 23372-2009《食品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》，以及一些期刊文獻(xiàn)中對(duì)香菇、大米、蝦油、藻類和海產(chǎn)品中砷形態(tài)的測(cè)定[5-9]。國(guó)標(biāo)法適用于常規(guī)的調(diào)味品食品檢測(cè)，對(duì)于基質(zhì)非常復(fù)雜的海產(chǎn)調(diào)味品，其高鹽、高油或高蛋白特性使得國(guó)標(biāo)法對(duì)海產(chǎn)調(diào)味品的檢測(cè)存在一定局限性，目前還未發(fā)現(xiàn)針對(duì)海產(chǎn)調(diào)味品的無(wú)機(jī)砷含量測(cè)定的相關(guān)研究報(bào)道，本方法針對(duì)海產(chǎn)調(diào)味品優(yōu)化國(guó)標(biāo)前處理方法，解決了存在的干擾因素，對(duì)建立海產(chǎn)調(diào)味品中無(wú)機(jī)砷含量的檢測(cè)方法意義重大。

1 材料與方法

1.1 試劑

濃硝酸：優(yōu)級(jí)純，濃度≥65%，為了得到高純度的酸，使用前經(jīng)亞沸蒸餾儀蒸餾備用；過(guò)氧化氫：CMOS級(jí)，濃度≥30%；氨水：ICP-MS級(jí)，濃度≥25%；三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液、五價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：品牌：Inorganic Ventures；砷甜菜堿標(biāo)準(zhǔn)溶液、一甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液、二甲基砷標(biāo)準(zhǔn)溶液：研制單位：中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；超純水：經(jīng)過(guò)超純水機(jī)制得，電阻率≥18.2 MΩ·cm；陰離子交換分析色譜柱和陰離子交換分析色譜保護(hù)柱(品牌：Prin-cen)。

液氬或高純氬氣:純度≥99.999%；高純氦氣：純度≥99.999%。

1.2 儀器

Agilent ICP-MS 7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；萬(wàn)分之一分析天平(精度0.0001 g，品牌:賽多利斯)；一次性注射器；水浴鍋：溫度可調(diào)至100 ℃；一次性塑料樣品瓶；帶蓋的50 mL塑料離心管、50 mL和1000 mL容量瓶，每次使用前至少在10%的硝酸中泡12 h，用蒸餾水洗干凈，在室溫下自然晾干備用；0.45 μm尼龍66濾膜過(guò)濾器；超純水機(jī)(Milli-Q)。

1.3 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作參數(shù)

使用的儀器為Agilent 7900電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(包括屏蔽炬、MicroMist霧化器),檢測(cè)質(zhì)量數(shù)m/z=75(As)，m/z=35(CL)，采集時(shí)間為0.5 s，具體參數(shù)見表1。

表1 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀工作參數(shù)Table 1 The working parameters of ICP-MS

1.4 液相色譜條件

1.4.1 色譜柱

陰離子交換分析色譜柱(柱長(zhǎng)50 mm，內(nèi)徑4.6 mm，品牌：Prin-cen)和陰離子交換分析色譜保護(hù)柱(柱長(zhǎng)50 mm，內(nèi)徑4.6 mm，品牌：Prin-cen)。

1.4.2 流動(dòng)相

流動(dòng)相A: 5 mmol/L的硝酸銨溶液；流動(dòng)相B：60 mmol/L的硝酸銨溶液。洗脫方式：梯度洗脫(見表2)。進(jìn)樣體積：10 μL。

表2 洗脫程序Table 2 The elution procedure

1.5 樣品處理方法

稱取1.0 g樣品于塑料離心管中，加入20 mL含3%過(guò)氧化氫0.15 mol/L硝酸混合溶液，于90 ℃水浴60 min，冷卻至室溫，加氨水調(diào)節(jié)pH至弱堿性，然后以6000 r/min離心10 min后取上清液，用0.45 μm濾膜過(guò)濾至塑料樣品瓶待測(cè)，按同一操作方法做空白試驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 陰離子色譜分析柱的篩選

為了選擇分離效果更好的陰離子分析柱，對(duì)Hamilton、Agilent 和Prin-cen 3種品牌的陰離子色譜分析柱進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.1 Agilent陰離子交換柱

根據(jù)國(guó)標(biāo)法GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》中HPLC-ICP-MS法的色譜條件用Agilent陰離子交換柱對(duì)DMA、As(Ⅲ)、MMA和As(V)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離，色譜圖見圖1。

圖1 4種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(20 μg/L)Fig.1 The chromatogram of standard solution in 4 arsenic species(20 μg/L)

分離所用時(shí)間為12 min，由圖1可知，DMA 和As(Ⅲ)的保留時(shí)間比較接近，分離度不高，兩個(gè)色譜峰靠得太近，往往會(huì)由于一個(gè)峰的峰面積太大而影響另一個(gè)峰的峰形，互相干擾而無(wú)法判斷色譜峰拐點(diǎn)，不利于色譜峰的積分，從而不能準(zhǔn)確定量。

2.1.2 Hamilton PRP-X100陰離子交換柱

使用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱對(duì)As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離，色譜圖見圖2。

圖2 5種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(5 μg/L)Fig.2 The chromatogram of standard solution in 5 arsenic species(5 μg/L)

由圖2可知，AsB、MMA和As(Ⅲ)靠得太近，保留時(shí)間相差0.5～0.6 min，同樣會(huì)由于一個(gè)峰的峰面積太大而影響另一個(gè)峰的峰形，互相干擾而無(wú)法判斷色譜峰拐點(diǎn)，分離時(shí)間接近12 min。

2.1.3 Prin-cen陰離子交換柱

使用Prin-cen陰離子交換柱對(duì)As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分離，色譜圖見圖3。

圖3 5種砷形態(tài)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(5 μg/L)Fig.3 The chromatogram of standard solutions in 5 arsenic species(5 μg/L)

由圖3可知，5種砷形態(tài)分離度高，分析所用時(shí)間為6 min,大大地提高了檢測(cè)效率。

綜上所述，Prin-cen陰離子色譜柱雖柱子短，但分離效果好，分離時(shí)間大大縮短，僅為6 min，能有效地提高檢測(cè)效率。

2.2 As(Ⅲ)的影響因素

海產(chǎn)調(diào)味品樣品基質(zhì)復(fù)雜，高鹽是其主要特點(diǎn)之一(如蝦醬)，所以本試驗(yàn)通過(guò)純水和氯化鈉-硝酸溶液作溶劑分別配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)As(Ⅴ)和As(Ⅲ)的影響因素進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用氯化鈉溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液中，As(Ⅲ)的峰形變寬、變矮，呈扁平狀，見圖4中b。值得注意的是，在接近4 min時(shí)有一個(gè)ArCl的分子離子干擾峰出現(xiàn)，但能被分離，不影響目標(biāo)峰的定性和定量。

圖4 1 μg/L 5種砷標(biāo)準(zhǔn)圖 Fig.4 The chromatograms of standard solutions in 5 arsenic species(1 μg/L)

2.3 As(Ⅴ)的影響因素

2.3.1 C18小柱對(duì)五價(jià)砷的影響

國(guó)標(biāo)法GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》中HPLC-ICP-MS法的前處理步驟中需要用C18小柱凈化樣品，為了驗(yàn)證C18小柱對(duì)五價(jià)砷的影響進(jìn)行了以下試驗(yàn):

以純水為溶劑配制的砷5種形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液通過(guò)C18凈化小柱(品牌：CNW)凈化后上機(jī)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)As(Ⅴ)損失近50%，而其他砷形態(tài)基本沒(méi)損失，疊圖見圖5(淺色是未過(guò)C18小柱的色譜圖，深色是過(guò)C18小柱的色譜圖)。

圖5 5 μg/L 5種砷標(biāo)準(zhǔn)疊圖Fig.5 The chromatogram of standard solutions in 5 arsenic species(5 μg/L)

因樣品試液含0.15 mol/L HNO3，所以以0.15 mol/L HNO3為溶劑配制的砷5種形態(tài)的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過(guò)C18小柱凈化后上機(jī)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)C18小柱處理后As(Ⅴ)損失近10%，而其他砷形態(tài)基本不損失。

通過(guò)試驗(yàn)證明C18小柱無(wú)論對(duì)水基體或者酸基體的As(Ⅴ)均有不同程度的吸附，嚴(yán)重者損失近50%，所以本方法將不使用C18小柱。

2.3.2 酸基體環(huán)境對(duì)系統(tǒng)中As(Ⅴ)的影響

為了試驗(yàn)酸基體環(huán)境對(duì)系統(tǒng)中As(Ⅴ)的影響，通過(guò)分析以0.15 mol/L HNO3為溶劑配制20 μg/L的As(Ⅴ)單標(biāo)溶液，然后連續(xù)分析0.15 mol/L HNO3的空白溶液，數(shù)據(jù)見表3。

表3 酸基體對(duì)As(Ⅴ)的殘留試驗(yàn)Table 3 The residue test of As (Ⅴ) on acid matrix

由表3可知，在酸基體中系統(tǒng)中As(Ⅴ)有殘留，且不容易清洗干凈，結(jié)論是含As(Ⅴ)高濃度樣品會(huì)對(duì)下一個(gè)樣品造成影響。根據(jù)Prin-cen陰離子交換色譜柱的pH適用范圍在7～13之間，說(shuō)明酸基體的樣品進(jìn)入系統(tǒng)后影響了流動(dòng)相中緩沖鹽的緩沖能力，從而導(dǎo)致pH改變，影響了色譜柱的性能。

2.3.3 弱堿性基體環(huán)境對(duì)系統(tǒng)中As(Ⅴ)的影響

為了驗(yàn)證弱堿性基體環(huán)境對(duì)系統(tǒng)中As(Ⅴ)的影響，用氨水將2.3.2中的標(biāo)準(zhǔn)溶液調(diào)節(jié)為弱堿性，儀器分析完標(biāo)準(zhǔn)溶液后，分析方法空白(用氨水將0.15 mol/L HNO3調(diào)節(jié)為弱堿性)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)中As(Ⅴ)基本沒(méi)有殘留，數(shù)據(jù)見表4。證明調(diào)節(jié)樣品的pH值至弱堿性的方法能避免As(Ⅴ)在系統(tǒng)中殘留。

表4 堿基體對(duì)As(Ⅴ)的殘留試驗(yàn)Table 4 The residue test of As(Ⅴ)on alkali matrix

2.4 前處理方法優(yōu)化——提取液選擇

為了尋求適用于海產(chǎn)調(diào)味品的無(wú)機(jī)砷含量檢測(cè)的前處理方法，分別考察了GB/T 23372-2009《食品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》和GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》的前處理方法，進(jìn)行了以下試驗(yàn)。

2.4.1 純水-熱浸提取法

參考GB/T 23372-2009《食品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》前處理方法，其特點(diǎn)是用純水-熱浸提，試驗(yàn)如下：

通過(guò)分析大米粉成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100348)，見圖6中b。檢測(cè)結(jié)果：As(Ⅲ)108 μg/kg和As(Ⅴ)62 μg/kg，無(wú)機(jī)砷總量為0.17 mg/kg，而大米無(wú)機(jī)砷理論值為(0.18±0.03)mg/kg，無(wú)機(jī)砷總量的檢測(cè)結(jié)果在允許范圍內(nèi)。

圖6 大米粉成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)色譜圖Fig.6 The chromatograms of standard substances of rice flour

通過(guò)分析以蝦醬為代表的海產(chǎn)調(diào)味品得到色譜圖，見圖7中a，發(fā)現(xiàn)As(Ⅲ)峰寬大,但As(V)分離較好，不受影響；通過(guò)添加As(Ⅲ)和As(V)混標(biāo)再次確認(rèn)As(Ⅲ)和As(V)的保留時(shí)間，見圖7中b。經(jīng)采用過(guò)氧化氫將As(Ⅲ)轉(zhuǎn)化為As(V)，見圖7中c，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原As(Ⅲ)峰位置確實(shí)存在雜質(zhì)干擾，As(Ⅲ)存在假陽(yáng)性。

圖7 蝦醬(a)、蝦醬加標(biāo)(b)、蝦醬使用過(guò)氧化氫 氧化法(c)的色譜圖Fig.7 The chromatograms of shrimp sauce(a), spiked shrimp sauce(b)and shrimp paste oxidized by hydrogen peroxide(c)

綜上所述，GB/T 23372-2009《食品中無(wú)機(jī)砷的測(cè)定 液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法》前處理方法只適用于大米等植物性樣品的檢測(cè)，但處理蝦醬等高鹽的基質(zhì)復(fù)雜的水產(chǎn)動(dòng)物類樣品時(shí)，因As(Ⅲ)峰有干擾，檢測(cè)還存在一定局限性，可以采用過(guò)氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以As(V)計(jì)算無(wú)機(jī)砷總量。

2.4.2 硝酸-熱浸提取法

參考GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》前處理方法,其特點(diǎn)是采用0.15 mol/L硝酸-熱浸提，試驗(yàn)如下:

通過(guò)分析大米粉成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100348)，見圖6中c，發(fā)現(xiàn)在As(Ⅲ)處不出峰，無(wú)法定量，但As(V)分離較好，不受影響。但采用過(guò)氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)后，以As(V)計(jì)算無(wú)機(jī)砷總量，檢測(cè)結(jié)果符合理論值。

同樣，處理蝦醬產(chǎn)品的色譜圖時(shí)(見圖8中b)，通過(guò)添加As(Ⅲ)和As(V)混標(biāo)再次確認(rèn)As(Ⅲ)和As(V)的出峰時(shí)間，見圖8中 c，發(fā)現(xiàn)在As(Ⅲ)處仍然不出峰，無(wú)法定量，但As(V)能定性且分離較好，不受影響。

圖8 As(Ⅲ)和As(V)混標(biāo)(a)、蝦醬(b)、 蝦醬加標(biāo)(c)色譜圖Fig.8 The chromatograms of mixed standard solution As(Ⅲ)and As(V), shrimp sauce(b) and spiked shrimp sauce(c)

綜上所述，采用兩種國(guó)標(biāo)方法都存在著局限性，主要體現(xiàn)在As(Ⅲ)不能分離或者出現(xiàn)干擾，而As(V)沒(méi)有影響，因此本試驗(yàn)結(jié)論是可以用過(guò)氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以避免對(duì)As(Ⅲ)的影響，最后以As(V)計(jì)算無(wú)機(jī)砷總量。

2.5 提取效率

根據(jù)以上結(jié)論采用過(guò)氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以避免對(duì)As(Ⅲ)的影響，分別考察了純水-熱浸提加氧化法和0.15 mol/L HNO3-熱浸提加氧化法的提取效率，試驗(yàn)通過(guò)對(duì)大米粉成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100348)和DORM4-魚蛋白進(jìn)行對(duì)比，平行測(cè)定7次，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以0.15 mol/L HNO3-熱浸提加氧化法的檢測(cè)結(jié)果更接近理論值，數(shù)據(jù)見表5。

表5 提取效率對(duì)比Table 5 The comparison of extraction efficiency

2.6 準(zhǔn)確度、精密度與回收率

對(duì)大米粉成分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW(E)100348)進(jìn)行分析以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度并計(jì)算其變異系數(shù)，平行測(cè)定7次，數(shù)據(jù)結(jié)果見表6，結(jié)果均符合證書要求。對(duì)3種海產(chǎn)調(diào)味品：蝦醬(高鹽類)、沙茶醬(高油類)、蠔油(高蛋白類)進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),并計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)結(jié)果見表7。

表6 大米粉標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分析結(jié)果Table 6 The analysis results of rice flour reference materials

表7 樣品加標(biāo)回收分析結(jié)果(n=7)Table 7 The analysis results of sample spiked recovery rates(n=7)

3 結(jié)論

本方法選用Prin-cen陰離子交換色譜短柱，在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的有效分離，能有效提高檢測(cè)效率,在國(guó)標(biāo)GB 5009.11-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總砷及無(wú)機(jī)砷的測(cè)定》前處理方法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)含3%過(guò)氧化氫0.15 mol/L硝酸溶液混合溶液提取樣品,同時(shí)過(guò)氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以避免酸基體和鹽基體對(duì)As(Ⅲ)的影響，然后將樣品試液調(diào)節(jié)至弱堿性以解決As(V)的系統(tǒng)殘留問(wèn)題，最后以As(V)計(jì)算無(wú)機(jī)砷總量。試驗(yàn)結(jié)果表明本方法簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠，適用于海產(chǎn)調(diào)味品中無(wú)機(jī)砷的檢測(cè)。