劉水英 尹建永 張芳菲 蘆澤源 王鋒

200233 上海，江蘇大學附屬上海市第八人民醫(yī)院腎內科(劉水英，王鋒)；200233 上海交通大學附屬第六人民醫(yī)院腎內科(尹建永，張芳菲，蘆澤源，王鋒)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是一種廣泛存在的臨床綜合征，其病死率仍居高不下，尤其是在重癥監(jiān)護病房(>50%)[1-2]，并且至今缺乏有效的治療干預措施。AKI長期以來被認為是一個可逆的過程，然而，在過去的數(shù)十年里，從動物模型和人類流行病學研究中得到的不斷發(fā)展的證據表明，很多AKI患者的腎功能并不能完全恢復，反而會在急性期后出現(xiàn)慢性化轉歸，逐步進展成慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)甚至終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)[3]。最近一項薈萃分析證實，與正常人相比，AKI患者進展為CKD的風險增加8.8倍，進展為ESRD的風險增加3.3倍；長期隨訪中約1/3以上的AKI患者進展至CKD或ESRD[4]。CKD在世界范圍內越來越普遍，除了增加患者的病死率之外，還對個人的生理和心理產生了強烈的負面影響。最近二十年來，CKD的發(fā)病率增加了三倍多；此外，根據世界衛(wèi)生組織報道，到2020年，它將成為全球死亡和殘疾的三大常見原因之一[5]。AKI已成為CKD及ESRD發(fā)生的獨立危險因素，日益受到重視。因此，探究AKI向CKD進展中的關鍵致病分子機制，從而進行針對性的干預已成為亟待解決的臨床問題。

一、腎小管上皮細胞異常修復

目前參與AKI后腎單位功能恢復的病理生理過程尚不完全清楚。在損傷后，腎小管細胞尤其是近端腎小管上皮細胞會失去極性及刷狀緣,膜蛋白比如β-整合素、Na+/K+-ATP酶錯位，如果損傷持續(xù)存在會導致小管細胞死亡[6]。在AKI后的正常修復過程當中，存活的小管細胞先去分化，然后沿基底膜遷移、增殖，最后分化，恢復還原成有功能的腎單位[7-9]。然而，在許多情況下，嚴重的AKI或AKI后存在腎功能受損，將誘導促纖維化信號，導致修復不良和CKD。近年來，對AKI的修復不良的發(fā)生機制提出了許多不同的理論和機制。上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)假說認為腎小管細胞損傷后發(fā)生表型轉化，表現(xiàn)為上皮標志物的丟失和間充質特征的獲得。然而，最近的一些包括使用遺傳細胞譜系追蹤的研究，未能發(fā)現(xiàn)分化轉移的證據，因此對這一概念提出了質疑[5，10-11]。但是，有研究發(fā)現(xiàn)小管上皮細胞經歷部分EMT，在疾病的發(fā)展過程中，細胞表達上皮細胞和間充質細胞的標志物，并與基底膜保持聯(lián)系。Lovisa等[12]進一步證明，該部分EMT足以通過在G2期細胞周期停滯，誘導小管功能受損，導致小管上皮細胞異?；謴停M而發(fā)展為腎纖維化。

二、細胞周期阻滯

1.腎臟細胞周期生理、病理生理學 細胞周期由4個具有特定特征的不同階段組成(G0～G1、S、G2和M期)。其中G2期是細胞有絲分裂(M期)前細胞快速生長和蛋白質合成的階段。在M期，細胞生長停止，并有序的進展到細胞分裂。細胞周期的進展被周期蛋白(cyclins)、周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)及其抑制劑(如p15、p16INK4a、p21和p27)精細控制[11]。CDK與cyclins形成復合物，導致CDK的激活和下游靶點的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，從而促進細胞周期的進展[11]。為了確保細胞周期過程的保真度，在細胞分裂期間存在許多稱為檢查點的質量控制步驟[11]。G2/M檢查點是細胞有絲分裂過程中一個重要的檢查點，常被DNA損傷激活。

正常生理條件下，小管上皮細胞分裂率極低。然而，在AKI后，細胞分裂率急劇增加，以取代壞死/凋亡細胞。這在近端小管的S3段尤其普遍[6]。輕度損傷后，存活的小管細胞增殖，覆蓋暴露的基底膜，恢復細胞數(shù)量[11]。結合增殖，這些細胞也會短暫地去分化，表達胚胎學標記物，然后再分化成特殊的小管細胞，導致腎單位的修復[9]。當新生的小管生長受阻、無法分化并萎縮時，這些小管表現(xiàn)出病理信號、旁分泌和自分泌活性，干擾腎間質和腎間質細胞之間的正常相互作用，導致異常修復和纖維化[13]。

2.G2/M期阻滯是AKI向CKD轉化的重要發(fā)病機制 一系列研究表明，腎小管上皮細胞中的G2/M期阻滯是導致AKI后異常修復和腎纖維化的重要驅動因素[14-16]。雖然腎小管上皮細胞不會轉分化為肌成纖維細胞，但受損的近端上皮細胞可以通過旁分泌機制在纖維化過程中發(fā)揮重要作用，其特征是G2/M期停滯和促進原纖維因子的產生。Yang等[14]證實G2/M期阻滯參與腎損傷后的纖維化,通過對腎損傷后腎小管上皮細胞周期行為的觀察，他們發(fā)現(xiàn)在G2/M期上皮細胞周期停滯與損傷后修復不良引起的腎纖維化之間存在因果關系;他們在缺血、藥物及梗阻所致AKI模型中發(fā)現(xiàn)，損傷后的小管細胞很多阻滯于G2/M期，無法去分化，呈現(xiàn)促纖維化的表型，能夠產生和分泌多種促纖維化因子，如轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)，進而促進腎臟纖維化進展。此外，近端小管上皮細胞阻滯于G2/M期可激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun NH2-terminal kinase，JNK)信號通路，上調促纖維化細胞因子的產生。這就建立了一個促纖維化的微環(huán)境，通過該微環(huán)境，成纖維細胞被永久激活[17]，表現(xiàn)為持續(xù)增殖和細胞外基質的沉積[6，18-19]。并且通過藥理學干預，增加損傷后G2/M期阻滯細胞數(shù)量可使纖維化結局惡化，而促進G2/M期活動的干預可減少纖維化[11，15-16]。以G2/M檢查點為靶點，在損傷階段維持細胞周期的正常進展，有望成為阻止CKD進展的一個有吸引力的治療靶點[11]。Cianciolo等[15]報道組蛋白乙酰酶抑制劑可減少G2/M期阻滯細胞數(shù)量，減少損傷后小管萎縮和間質纖維化。有研究表明Twist(編碼Twist家族bHLH轉錄因子1)和Snail 1(編碼Snail家族鋅指蛋白1)轉基因的表達，可促進持續(xù)的TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞的G2期阻滯，用TGF-β1體外誘導EMT也會誘導腎小管上皮細胞產生G2/M期阻滯，限制細胞的再生和修復潛能；通過敲除Twist和Snail 1基因抑制EMT，導致G2/M期抑制的小管上皮細胞數(shù)量顯著減少，可減少腎實質和間質性纖維化[20-21]。

3.參與AKI后G2/M期阻滯調控的相關因子 然而，G2/M期阻滯細胞分泌促纖維化因子的確切細胞機制尚不清楚。近年來，許多學者對腎小管上皮細胞G2/M期調控進行了研究，為腎臟纖維化進展開辟了新的治療途徑。

(1)毛細血管共濟失調突變基因/Rad3相關蛋白激酶通路：DNA損傷導致毛細血管共濟失調突變基因/Rad3相關蛋白激酶(Ataxia Telangiectasia Mutated/Ataxia Telangiectasia and Rad3-related protein，ATM/ATR)通路活化，細胞周期檢查點激酶(checkpoint kinase 2，CHK2)活化后磷酸化抑癌基因p53和磷酸酶cdc25，抑制Cdc2導致G2/M阻滯[22-25]。在正常情況下，這種阻滯確保了DNA在繼續(xù)有絲分裂前的修復時間，研究中發(fā)現(xiàn)這種突變的細胞更易受到DNA損傷和基因組不穩(wěn)定的影響，并經歷G2/M期停滯。這導致范可尼貧血相關核酸酶1突變的患者發(fā)生腎小管萎縮和纖維化[26]。Romanov等[27]發(fā)現(xiàn)低劑量的馬兜鈴酸通過激活DNA損傷檢查點通路ATM-CHK2-p53-p21，引起活性氧產量的增加，可導致p53依賴的p21積累，在G2/M期誘導細胞周期阻滯。p21是Nishioka等[28]最早探索的蛋白之一，這種蛋白似乎在AKI和CKD進展過程中發(fā)揮不同的作用。p21在AKI期間似乎具有保護作用，這是通過p21-/-小鼠有更明顯的腎功能障礙和死亡率來評估的，而在5/6腎切除術后CKD的進展過程中，p21-/-小鼠的組織病理學損傷較少。p53是p21轉錄的調節(jié)因子，在AKI后也會上調，其抑制或基因缺失可減少腎臟損害[29]。Liu等[30]在細胞培養(yǎng)(人和大鼠腎小管上皮細胞)和小鼠單側輸尿管梗阻模型中發(fā)現(xiàn)了一個缺氧激活的p53反應的促纖維化通路，在缺氧時，由缺氧誘導因子誘導的p53上調抑制細胞周期進展，導致G2/M期細胞的積累，并激活促纖維化因子TGF-β和CTGF介導的信號通路，導致細胞外基質產生和腎纖維化。

(2)p38-絲裂原活化蛋白激酶通路和Wee1激酶：不同應激刺激(如缺氧)也可通過p38-絲裂原活化蛋白激酶(p38-mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路誘導G2/M期阻滯。MAPK可以磷酸化cdc25，導致其泛素化。因此，cdc25不再能夠激活Cdc2/cyclin A復合物，從而抑制G2期到M期的轉變[31]。Borst等[32]報道的另一項重要發(fā)現(xiàn)表明，MAPK信號通路的重要中介物JNK，即使在嚴重缺血損傷后數(shù)周，在近端小管上皮細胞中仍被激活。這種持續(xù)的激活是由于G2/M期細胞被抑制，導致促纖維化細胞因子的上調。馬兜鈴酸處理的細胞中產生大量活性氧，3個主要的MAPKs中，ERK1/2和p38被激活，而JNK未被激活；通過藥物抑制ERK1/2和p38以及N-乙酰-L-半胱氨酸抑制活性氧生成，可以減少部分G2/M檢查點細胞，減輕腎臟纖維化，腎小管上皮細胞凋亡水平下降[27]。Chen等[33]發(fā)現(xiàn)人Wharton's Jelly間質基質細胞來源的微泡(microvesicles，MVs)可以通過ERK1/2信號傳導減輕G2/M期阻滯，從而緩解缺血再灌注損傷大鼠的腎臟纖維化。

G2/M阻滯的第三個重要介質是Wee1激酶。Wee1是一種酪氨酸激酶，它通過磷酸化Cdc2的酪氨酸殘基使Cdc2處于非活性狀態(tài)[34]。Cdc2的再活化是通過cdc25去磷酸化實現(xiàn)的[35]。

(3)其他機制(如自噬、microRNA)：Liu等[36]首次發(fā)現(xiàn)缺氧時，miR-493在近端小管上皮細胞中高表達，而降低了細胞周期調節(jié)因子STMN-1的表達，增加了G2/M期細胞和促纖維化因子在近端小管上皮細胞中的比例，這些作用可以通過miR-493抑制劑在體外逆轉，表明miR-493-STMN-1通路參與了缺氧誘導的腎小管上皮細胞G2/M期阻滯和腎纖維化。

Li等[37]發(fā)現(xiàn)西羅莫司增強自噬可以抑制膠原蛋白1的積累和腎纖維化；而通過近端小管上皮細胞特異性缺失自噬相關基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)消融自噬，細胞周期在G2/M期明顯停止，間質纖維化嚴重，ATG5表達增強，可拯救G2/M期阻滯，表明ATG5介導的近端上皮細胞自噬是一種關鍵的宿主防御機制，通過阻斷G2/M阻滯來預防腎纖維化。Canaud等[38]進一步證實了近端腎小管細胞在G2/M期成為西羅莫司自噬空間偶聯(lián)區(qū)(TOR-autophagy spatial coupling compartments，TASCCs)的靶點，從而促進了類似于衰老相關分泌表型的促纖維化分泌；細胞周期蛋白G1可促進腎小管上皮細胞中G2/M期阻滯和TASCC的形成，細胞周期蛋白G1的缺失減少了體內G2/M期細胞和TASCC的形成；特異性敲除小管上皮細胞中TASCC關鍵成分可降低CKD小鼠的腎纖維化進展速度。

綜上所述，我們對近年來AKI向CKD轉化的認識進展強調了腎小管上皮G2/M期阻滯在異常修復過程中的重要作用，其中對G2/M期阻滯調控相關因子的研究，為設計有針對性的治療策略以促進適應性腎臟修復和減少AKJ后的進展為腎纖維化和CKD提供了重要的機會。