元榮榮,張 宇,魏丹丹,林旭紅

1.河南大學淮河醫(yī)院 內(nèi)分泌科,河南 開封475000；2.河南大學淮河醫(yī)院腎內(nèi)科,河南 開封475000；3.河南大學淮河醫(yī)院檢驗科,河南 開封475000

近年來,潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)的發(fā)病率呈上升趨勢,流行病學統(tǒng)計,我國UC的患病率約為0.02‰[1-2]。目前,活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)及活性氮在UC產(chǎn)生的病理生理機制中日益受到重視[3]。ROS可以激活絲裂原蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的ERK、JNK和P38 MAPK[4]。而在腸上皮細胞系中,溶組織阿米巴能激活NOX2,增加氧自由基的生成,導致細胞死亡。因此,NOX2能增加氧自由基的生成,而氧自由基能激活或抑制P38 MAPK。但是對NOX2-ROS-P38-PGE2/NO信號通路在潰瘍性結(jié)腸炎中作用的認識并不十分清楚,本實驗探討香草乙酮對NOX-ROS-P38信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 在細胞系THP-1(購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫)中過表達NOX2，觀察ROS及p-P38表達

構(gòu)建pc DNA3.1-NOX2表達質(zhì)粒,應用lipo 2 000 invitrogen轉(zhuǎn)染細胞,一般待細胞密度達到90%時轉(zhuǎn)染細胞,首先配制含0.8μg DNA的50μL Opti-mem無血清培養(yǎng)基及含2μL lipo 2 000的50 μL Opti-mem無血清培養(yǎng)基,混勻、室溫放置5 min,然后將二者混合,放置20 min,轉(zhuǎn)染期間,將24孔板培養(yǎng)基換成無血清培養(yǎng)基,每孔400μL,將混合液加入對應孔中,4～6 h后換成有血清培養(yǎng)基,實驗組于次日更換成含有香草乙酮的培養(yǎng)液,對照組于次日更換成無香草乙酮的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,應用細胞氧化應激活性氧(ROS)魯米諾化學發(fā)光法定量檢測試劑盒(購自上海寶曼生物科技有限公司)檢測ROS,并用Real time PCR檢測p-P38基因的表達。

1.2 RNAi技術(shù)敲除細胞NOX2基因，觀察ROS及p-P38表達

Invitrogen公司合成用于沉默NOX2的si-NOX2RNA dimer及作為對照的si-Scrambled RNA dimer,用細胞核電穿孔儀(Lonza Company)轉(zhuǎn)染THP-1細胞,并與次日更換成含有香草乙酮的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,應用動物細胞氧化應激活性氧(ROS)魯米諾化學發(fā)光法定量檢測試劑盒檢測ROS,并用Real time PCR檢測p-P38基因的表達。實驗中同時設(shè)置轉(zhuǎn)染GFP孔檢測基因敲除效率。

1.3 SOD阻斷ROS在細胞系THP-1中生成及低氧刺激ROS生成，應用Real time PCR檢測p-P38及NOX2

實驗分組,對照組不干預ROS,阻斷ROS組和刺激ROS組。

1.3.1 SOD阻斷ROS生成

將N-乙酰半胱氨酸(NAC)加入細胞培養(yǎng)液中,做MTT實驗確定最佳NAC濃度,孵育1～2 h,利用DHE染色觀察ROS被抑制情況。

1.3.2 低氧刺激ROS生成

將細胞置于低氧條件的儀器中(美國Biospherix低氧箱),其中1%O2、94%N2、5%CO2,對照組細胞處于21%O2、74%N2、5%CO2的條件下,應用DHE染色觀察ROS生成。

1.3.3 Real time PCR檢測p-P38及NOX2基因表達

從細胞中提取總RNA,用分光光度法測定所提取RNA的濃度,并用RNA電泳檢測其完整性,然后進行m RNA反轉(zhuǎn)錄,最后PCR檢測：采用premier 5.0設(shè)計p-P38和NOX2基因引物序列,將每個cDNA樣品2μL 進行實時熒光定量PCR擴增,每個標本做復孔檢測。熱循環(huán)參數(shù)如下：95℃30 s 為第一階段,一個循環(huán)；95℃5 s,60℃31 s為第二階段,40個循環(huán)。用ABI 7500系統(tǒng)軟件進行數(shù)據(jù)采集、分析。

2 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以x-±s表示。使用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件,采用單因素方差分析的方法進行統(tǒng)計分析,方差分析后的兩兩比較采用S-N-K檢驗,P＜0.05,差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 在細胞系THP-1中過表達NOX2，ROS及p-P38表達

在細胞系THP-1中過表達NOX2,經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后,ROS的表達下降,與對照組相比有顯著差異,P＜0.01；經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后,p-P38的表達下降,與對照組相比有顯著差異,P＜0.05。

3.2 敲除細胞NOX2基因，ROS及p-P38表達

不敲除NOX2基因,經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后ROS和p-P38表達減少,與敲除組相比,差異有統(tǒng)計學意義,P＜0.01,P＜0.05。

3.3 阻斷和刺激ROS，NOX2及p-P38表達

阻斷ROS后,3組NOX2的表達無統(tǒng)計學差異,P＞0.05。低氧刺激ROS后p-P38表達較對照組顯著增加,與對照組比有統(tǒng)計學差異,P＜0.01；SOD阻斷ROS后p-P38表達較對照組顯著減少,與對照組比有統(tǒng)計學差異,P＜0.01。

4 討論

研究[3-4]發(fā)現(xiàn),氧化應激引起的機體免疫功能紊亂可能在潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機制中有重要作用,ROS是氧化應激反應的分子基礎(chǔ)。我們研究發(fā)現(xiàn),香草乙酮治療潰瘍性結(jié)腸炎小鼠后NOX2活性及ROS生成被抑制,P38 MAPK磷酸化水平降低。因此推測NOX-ROS-P38信號通路在香草乙酮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的分子機制中發(fā)揮重要作用。

本實驗在THP-1細胞系中研究香草乙酮對NOX-ROS-P38信號通路的影響。實驗結(jié)果顯示,在THP-1細胞系中阻斷ROS的生成,p-P38表達明顯減少(P＜0.01),刺激ROS后,p-P38的表達明顯增加(P＜0.01),但NOX2的表達均不受影響,說明P38在ROS的下游,NOX在ROS的上游。

在過表達NOX2時,應用香草乙酮培養(yǎng)細胞后,ROS和p-P38的表達均減少(P＜0.01,P＜0.05)。經(jīng)香草乙酮培養(yǎng)后,NOX2基因不敲除組的ROS及p-P38的表達較基因敲除組的減少(P＜0.01,P＜0.05)。研究[5-7]發(fā)現(xiàn),在中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、內(nèi)皮細胞中,香草乙酮通過阻斷NADPH氧化酶的活性而抑制氧自由基的生成。因此推測香草乙酮可能通過抑制NOX2的活性或抑制NOX2促進ROS的生成過程來抑制ROS的生成,進而抑制p38 MAPK磷酸化,但其具體作用機制尚待進一步研究。