梁蓓蕾， 王佐林

（上海牙組織修復與再生工程技術研究中心，同濟大學口腔醫(yī)學院·同濟大學附屬口腔醫(yī)院種植科，上海 200072）

腫瘤切除、牙周炎等引起的骨缺損，通常需要使用骨生物材料進行手術治療[1]。 作為異物，植入物被免疫系統(tǒng)識別并引發(fā)顯著的免疫反應，繼而影響成骨細胞的生物學行為。 在這一背景下，骨生物材料的設計范例已從相對惰性轉變?yōu)橹鲃用庖哒{節(jié)[2]。 巨噬細胞作為第1 批到達的免疫細胞，其隨局部環(huán)境產生不同功能表型的能力，使骨生物材料的免疫調節(jié)功能成為可能，因而在骨組織再生領域備受關注[3]。

1 巨噬細胞及其極化

巨噬細胞（macrophage）因其吞噬效應消除有害病原體的保護作用而聞名[4]。 過去公認的巨噬細胞主要來源于髓系單核細胞，通過響應受損組織或與病原體相關信號經循環(huán)系統(tǒng)進入組織發(fā)揮免疫作用。 但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，早在胚胎發(fā)育過程中即已產生一些組織駐留的巨噬細胞， 在損傷期間，通過快速增殖維持其局部群體， 共同參與組織修復、免疫監(jiān)視和體內穩(wěn)態(tài)的維持[5]。

巨噬細胞極化是巨噬細胞響應局部微環(huán)境中的信號， 分化為具有不同功能表型頻譜細胞的過程[6]。 早在20 世紀90 年代初期，干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）和脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導活化的巨噬細胞已被定義為經典活化型巨噬細胞，它們通過分泌大量炎性細胞因子[如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）]及趨化因子（如CC 趨化因子配體2）參與炎癥反應及殺菌過程[7]。 而隨后的研究發(fā)現(xiàn)，IL-4 誘導活化的巨噬細胞的吞噬和殺傷效應明顯下降，轉而通過分泌抗炎因子（如IL-10），生長因子[如轉化生長因子-β（transforming growth factorβ， TGF-β）， 血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）]等發(fā)揮抗炎作用，并通過調節(jié)細胞外基質沉積、 血管生成等參與組織修復過程。為表示區(qū)分，此類巨噬細胞被定義為“替代活化型巨噬細胞”[8]。

隨后鏡像“Th1/Th2”細胞命名法，“M1/M2”二分法被提出以分別對應此前提出的經典/替代活化型巨噬細胞的定義，M0 則被用以標記未活化巨噬細胞亞型。 第3 代的定義將M2 型巨噬細胞進一步區(qū)分為M2a、M2b 和M2c 3 種亞群[9]。 M2a 表型響應IL-4 和IL-13，以增加表面標志物CD206、精氨酸酶和TGF-β 的表達為特征；M2b 表型暴露于IgG 免疫復合物和IL-1β， 增加IL-10 的產生并降低IL-12；M2c 表型則在IL-10、TGF-β 或糖皮質激素刺激作用下產生， 其特征是高表達IL-10 和表面受體CD163。但是，巨噬細胞的極化類型可隨時通過局部微環(huán)境的變化發(fā)生相互轉化。 巨噬細胞極化應該被視為一個具有系列表型的平衡譜，而不是簡單理解為劃分為群的狀態(tài)[7]。 由于表達標記的重疊，目前最常使用的依然是“M1/M2 型”或“M1/M2 樣”分類方法[4]。

2 骨組織再生的過程

當骨組織受到損傷時，血管破裂，血小板被激活，多種凝血因子、細胞因子及趨化因子釋放，引發(fā)止血效應， 多種類型細胞受募集遷移至損傷部位，促成骨組織修復的初始階段[9]。 生物材料作為異物，一旦被植入，材料表面將吸附血漿蛋白以形成蛋白吸附層，從而啟動血小板和其他血液凝固因子誘導的先天性免疫反應，骨再生開始[10]。

中性粒細胞首先到達損傷部位， 并提供信號分子，募集巨噬細胞到達損傷部位[11]。其后，巨噬細胞開始占據(jù)主導地位[9]，通過分泌細胞因子和趨化因子，進一步募集白細胞。 此外，巨噬細胞能夠去除凋亡的中性粒細胞， 其吞噬作用可能導致更多M1 型巨噬細胞向M2 型巨噬細胞改變和炎癥期的消退[3]。其他免疫細胞， 也通過局部分泌參與傷口愈合的早期階段，并影響單核/巨噬細胞的極化與破骨分化[11]。

隨后的增殖期涉及細胞增殖、血管生成、膠原沉積[12]。 該期間巨噬細胞的參與和極化可能對隨后的重塑階段產生顯著影響。 間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs） 增殖及膠原蛋白沉積所需的一些支持性生長因子，包括TGF-β 及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMPs）等均可由巨噬細胞分泌[1]。

在沉積大量膠原后，重塑階段開始。 軟的愈傷組織礦化并轉化為具有不規(guī)則排列的（編織）骨的骨愈傷組織，并伴有新生血管侵入[9]。 隨后編織骨重塑為正常的層狀骨，這依賴于成骨細胞和破骨細胞功能的平衡[13]。 巨噬細胞作為破骨細胞同源細胞或前體細胞[14]，似乎能夠參與協(xié)調骨代謝平衡。

3 巨噬細胞及其極化與骨組織修復的關系

如上所述，巨噬細胞是骨組織再生過程中的關鍵介質。 首先，巨噬細胞能夠通過吞噬作用清除侵入的生物體、受損的細胞碎片及凋亡的中性粒細胞等；其次，巨噬細胞響應組織微環(huán)境的變化而大量增殖并經歷顯著的表型及功能改變，成為各類細胞外基質成分和促組織修復再生的可溶性介質的有效來源[2]；再次，巨噬細胞還可通過調節(jié)參與骨愈合過程的細胞（如MSCs）在組織再生中發(fā)揮關鍵作用[5]，并能激活環(huán)境中的其他細胞以表達更多對骨構建有益但不主要由其產生的細胞因子，各種細胞類型之間串擾為骨再生的動態(tài)調節(jié)提供了基礎[14]。

多項動物實驗進一步證實了巨噬細胞的重要性。 骨損傷修復過程中的巨噬細胞耗竭導致骨愈合受損，巨噬細胞缺陷動物的愈傷組織較小，骨含量較少[3]。此外，巨噬細胞的重要性還具有一定的時間效應。 軟骨內骨折愈合的小鼠若在炎癥早期耗竭巨噬細胞，軟骨性軟愈傷組織的形成被完全消除，而在后期耗竭巨噬細胞則導致愈傷組織變小，愈傷組織的大小與愈傷組織中剩余巨噬細胞的數(shù)量成正比[15]。需要關注的是，巨噬細胞被“激活”可獲得一系列表型，各極化亞型在骨組織再生過程中的作用也成為了研究的熱點課題。

3.1 M0 巨噬細胞對骨組織再生的影響

Chang 等[16]關注了原代成骨細胞培養(yǎng)物的異質性，發(fā)現(xiàn)從小鼠顱骨分離的原始成骨細胞培養(yǎng)物中含有11%～17%的F4/80 +巨噬細胞。 從原代培養(yǎng)物中耗盡巨噬細胞時，礦化和成骨細胞分化基因的表達顯著降低。Nicolaidou 等[17]發(fā)現(xiàn)單核細胞產生的抑瘤素M（oncostatin-M，OSM）能增強人MSCs 成骨分化。 然而也有學者認為分泌在巨噬細胞上清液中的IL-1β、TNF-α 等細胞因子對成骨分化起抑制作用[18]。

3.2 M1 巨噬細胞對骨組織再生的影響

傳統(tǒng)觀點認為，經典活化的炎性巨噬細胞（M1）分泌大量炎性細胞因子， 上調核因子κB 受體活化因 子 配 體 （receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL），增強破骨細胞的分化和吸收，導致骨量表達降低[19]。然而，高碩等[20]發(fā)現(xiàn)LPS 存在的炎性條件下， 巨噬細胞能增強MSCs 的遷移能力。 此外， 在Transwell 系統(tǒng)中，LPS 活化的巨噬細胞共培養(yǎng)的小鼠成骨細胞，顯示出更明顯的鈣化[14]。

3.3 M2 巨噬細胞對骨組織再生的影響

Gong 等[21]發(fā)現(xiàn)與M2 巨噬細胞共培養(yǎng)的MSCs中ALP 活性及骨礦化增加， 成骨相關基因上調，這些結果可能是由M2 巨噬細胞產生的促再生細胞因子（如TGF-β、血管內皮生長因子等）介導的。 Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)，各型巨噬細胞均以不同方式影響骨髓間充質干細胞的成骨分化，M0 和M1 巨噬細胞部分增強了早期和中期的成骨效應，但未促進細胞外基質礦化；而與M2 巨噬細胞直接或間接共培養(yǎng)的MSCs獲得更明顯的基質礦化。

綜上所述， 在不同實驗室的特定共培養(yǎng)條件下，所有巨噬細胞亞型對骨再生的作用似乎是一個有趣而矛盾的結果。 但Spiller 等[23]的研究可能帶來新的思路，該研究認為在血管網(wǎng)發(fā)芽、吻合和成熟過程中，M1 巨噬細胞分泌引發(fā)血管生成過程的因子（如血管內皮生長因子）；M2a 巨噬細胞促進血管融合， 并可能通過PDGF-BB 的分泌募集周細胞；M2c 巨噬細胞則促進內皮細胞體外發(fā)芽，并分泌高水平的MMP9 在血管重構中發(fā)揮重要作用。 這項研究的結果顯示了巨噬細胞控制血管生成的復雜性。同樣， 骨組織再生過程也是一個復雜的機體反應，在此過程中，各型巨噬細胞可能也需要不同階段協(xié)同作用才能得到最終的重塑骨組織。

4 通過調節(jié)巨噬細胞極化促進骨組織再生

基于巨噬細胞的功能可塑性及其與骨組織再生的串擾，通過靶向巨噬細胞來促進骨組織再生的生物材料備受關注，其策略主要分為2 種。 一種是調節(jié)骨缺損部位巨噬細胞的數(shù)量。 Raggatt 等[15]提出，通過增加骨折部位巨噬細胞數(shù)量的方法可以增強骨再生。 這些研究表明，損傷時局部注射巨噬細胞集落刺激因子（monocyte colony-stimulating factor，M-CSF）可顯著增加骨折部位巨噬細胞的數(shù)量，從而改善膜內骨和軟骨內骨的形成。 另一種是通過改變骨修復材料的理化性質和生物材料釋放的離子和可溶性因子等， 調節(jié)局部巨噬細胞極化以支持骨再生。天然的光滑鈦會引起急性炎癥和M1 極化，而經硅烷化處理的鈦的炎癥性則明顯降低，并能通過適度參與NF-κB 信號傳導途徑促進巨噬細胞M2 極化[24]。 含鍶生物活性玻璃微球（strontium-contained bioactive glasses microspheres， SrBGM）可通過將M1轉化為M2 來調節(jié)巨噬細胞表型， 并表達高水平的PDGF-BB，有助于早期血管生成，并促進體內新骨形成[25]。 Chen 等[26]制備了二氧化鈦納米管上的雙水凝膠層系統(tǒng)作為儲庫， 通過IFN-γ 和IL-4 的順序作用來調節(jié)從M1 到M2 的巨噬細胞表型轉換，分子的順序釋放受自然愈合過程的啟發(fā)， 滿足順序釋放策略要求的材料的開發(fā)有望顯著提高組織工程中免疫調節(jié)的技術水平。

綜上所述，巨噬細胞及其響應局部微環(huán)境所獲得獨特的功能表型在骨組織再生過程中具有重要意義，通過調節(jié)巨噬細胞改變骨再生相關細胞命運和行為的有效性已得到很好的證實。 但對于特定線索對巨噬細胞行為及其后續(xù)功能影響的細節(jié)的理解尚不完整， 一些實驗數(shù)據(jù)尚不確定或相互矛盾，這就使基于此設計的組織工程材料的臨床轉化受到限制。 因此，充分了解巨噬細胞及其極化在骨組織再生過程中的細節(jié)（如各極化類型出現(xiàn)的時期、比例狀態(tài)、功能作用等），并在此基礎上更加有效地選擇巨噬細胞極化的時間點及方式，將會成為未來實現(xiàn)更好的組織工程材料開發(fā)及臨床轉化的重要研究方向。