沈君顏, 王 浩 綜述, 劉海亮，2 審校

(1. 同濟大學(xué)醫(yī)學(xué)院再生醫(yī)學(xué)系，上海 200092； 2. 同濟大學(xué)附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSCs)是一類非胚胎來源的成體多能干細(xì)胞，存在于骨髓、肌肉、脂肪、臍帶、皮膚等多種組織中[1]。除具備高度自我更新能力外，在一定誘導(dǎo)條件下，MSCs可實現(xiàn)向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及肌肉細(xì)胞等多向分化[2-3]。研究表明，MSCs幾乎不表達(dá)與人類白細(xì)胞抗原識別有關(guān)的共刺激分子及主要組織相容性復(fù)合物[4]，具有較低的免疫原性；并可在組織損傷及炎癥反應(yīng)中，分泌大量趨化因子并向損傷部位遷移，進(jìn)而發(fā)揮炎癥調(diào)控及組織修復(fù)功能[5]。基于以上特性，MSCs被視為可用于修復(fù)衰老或病變引起的組織器官損傷的“理想種子細(xì)胞”[6]。

成骨細(xì)胞可分泌有機骨基質(zhì)，促進(jìn)骨基質(zhì)礦化，維持骨穩(wěn)態(tài)[7]。成骨細(xì)胞生成障礙或功能失調(diào)可引起骨組織微結(jié)構(gòu)破壞、骨形成缺陷，導(dǎo)致骨代謝疾病如骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎等。而MSCs分化為成骨細(xì)胞是成骨細(xì)胞形成的主要途徑[8]，其在骨形成和功能維持中起著關(guān)鍵作用。大量研究表明，miRNA可直接或間接地調(diào)控MSCs成骨分化過程[8-9]。本文通過對MSCs成骨分化過程中miRNA的作用和機制進(jìn)行總結(jié)，認(rèn)識miRNA在這一過程中的調(diào)控功能，深入理解與此過程相關(guān)的骨代謝疾病發(fā)病機制。

1 MSCs成骨分化機制

MSCs依次分化為成骨祖細(xì)胞、成骨細(xì)胞，隨后經(jīng)過多種細(xì)胞外基質(zhì)的礦化，成骨細(xì)胞逐漸成為成熟的骨細(xì)胞[10]。過去的幾十年里，大量的分泌因子和轉(zhuǎn)錄因子已被確定可調(diào)節(jié)成骨發(fā)生。成骨細(xì)胞特異的Runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX family transcription factor 2, RUNX2)及SP7轉(zhuǎn)錄因子(Sp7 transcription factor, OSTERIX)對于MSCs向成骨細(xì)胞分化及功能性成骨細(xì)胞的形成都是必需的[11]。另外，成骨細(xì)胞的分化成熟也涉及Wnt[12]、BMP信號通路[13]及PI3K/Akt信號通路[14]等。

2 miRNA的形成及其生物學(xué)功能

miRNA是一類長度約為19～22個核苷酸(nucleotide, nt)的非編碼RNA。在細(xì)胞核中，miRNA由原始miRNA(pri-miRNA)經(jīng)核酸酶Drosha切割成短的約70nt的前體miRNA(pre-miRNA)，其具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)[15]，通常包含-5p、-3p，且3′端有2nt的突出。隨即pre-miRNA由輸出蛋白5轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)，再由胞質(zhì)中的Dicer酶等將其切割為約20nt的雙鏈RNA。雙鏈RNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，在發(fā)揮作用的過程中，一條鏈被剪切降解，另一條鏈則被選擇為約20nt的功能鏈[16]。miRNA與mRNA分子3′非翻譯區(qū)(untranslated region, UTR)互補的靶位點結(jié)合，當(dāng)兩者不完全互補時，主要影響翻譯過程，而對mRNA的穩(wěn)定性沒有影響，動物細(xì)胞內(nèi)大多采用此調(diào)控方式[17]；當(dāng)兩者完全互補時，則miRNA發(fā)揮剪切功能，特異性切割mRNA，最終導(dǎo)致翻譯抑制或目標(biāo)mRNA降解[18]。最近的研究表明，miRNA通過靶向各種參與MSCs自我更新和分化的基因直接或間接調(diào)節(jié)MSCs的成骨分化[19-21]。

3 miRNA調(diào)控MSCs成骨分化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子

MSCs成骨分化的過程受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，例如RUNX2、OSTERIX、特異AT序列結(jié)合蛋白2(SATB homeobox 2, SATB2)和遠(yuǎn)端同源異型盒(distal less homeobox, DLX)等，其中RUNX2及其下游OSTERIX轉(zhuǎn)錄因子是最重要的成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控成骨祖細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化及成熟的過程[11]。

3.1 RUNX2

RUNX2是Runxx家族成員之一[22]，被認(rèn)為是成骨分化和骨形成過程最關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子[23]，在骨組織的形成和重建中發(fā)揮重要作用。小鼠RUNX2敲除可引起成骨細(xì)胞成熟過程停滯，導(dǎo)致骨發(fā)生完全缺乏[24]。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)11個靶向RUNX2的miRNA(miR-23a、miR-30c、miR-34c、miR-133a、miR-135a、miR-137、miR-204、miR-205、miR-217、miR-218和miR-338)，在不同的MSCs相關(guān)細(xì)胞呈譜系特異性表達(dá)模式，且在成骨分化過程中呈現(xiàn)與RUNX2相反的表達(dá)模式。其中10種miRNA(除miR-218外)都被證實可顯著抑制成骨分化，且此過程可被其對應(yīng)的anti-miRNA逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明調(diào)控RUNX2的功能性miRNA群體形成一個復(fù)雜的系統(tǒng)，影響成骨細(xì)胞形成。最近，研究通過對萎縮性非愈合骨折患者與正常愈合骨折患者差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行篩選，miR-628-3p和miR-654-5p在非愈合骨折患者中高表達(dá)，且在成骨分化過程持續(xù)高表達(dá)[25-26]。功能實驗證實miR-628-3p可抑制MSCs成骨分化，進(jìn)一步生物信息學(xué)分析及雙熒光報告素酶(Luciferase)實驗發(fā)現(xiàn)miR-628-3p與RUNX2的3′UTR 有兩個靶位點結(jié)合，過表達(dá)miR-628-3p使RUNX2的表達(dá)在mRNA和蛋白水平均降低。表1詳細(xì)展示了影響RUNX2的表達(dá)從而調(diào)節(jié)MSCs成骨分化的miRNAs。

3.2 OSTERIX

OSTERIX是一種含鋅指的轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)育的骨骼中特異性表達(dá)，它的特異性缺失可導(dǎo)致小鼠骨形成能力喪失[36]。大量研究表明OSTERIX在成骨分化和骨形成過程中發(fā)揮重要作用[37]。miR-143是MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化的抑制因子，且在分化過程表達(dá)降低。OSTERIX是miR-143的一個直接靶基因，抑制OSTERIX的表達(dá)，MC3T3-E1成骨分化性能減弱，過表達(dá)OSTERIX則可部分恢復(fù)miR-143的抑制作用。表明miR-143作為一個新的OSTERIX的調(diào)控子在成骨分化過程發(fā)揮重要作用[38]。Yang等[39]發(fā)現(xiàn)，miR-93是成骨細(xì)胞礦化過程中表達(dá)下調(diào)最為明顯的miRNA。在小鼠原代培養(yǎng)的成骨細(xì)胞中過表達(dá)miR-93可減弱成骨細(xì)胞的礦化。Luciferase實驗顯示miR-93直接靶向OSTERIX的編碼區(qū)，電泳遷移率變動分析及染色質(zhì)免疫沉淀證實OSTERIX與miR-93的啟動子結(jié)合。另外，過表OSTERIX會減少miR-93的轉(zhuǎn)錄，反之miR-93轉(zhuǎn)錄增加。這些結(jié)果表明miR-93作為成骨細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，通過新型的miR-93/OSTERIX調(diào)節(jié)反饋環(huán)來發(fā)揮其調(diào)控作用。

同樣，miR-96也是以O(shè)STERIX為靶基因來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化。miR-96在老年骨質(zhì)疏松癥患者的血清及老年人、小鼠來源的骨髓MSCs都高表達(dá)。過表達(dá)miR-96可抑制骨髓MSCs的成骨分化，反之則促進(jìn)。通過靜脈注射在幼鼠體內(nèi)過表達(dá)miR-96會引起成骨形成受損，導(dǎo)致低骨量。在老年小鼠中，對miR-96的抑制可減輕年齡相關(guān)性骨丟失[40]。骨質(zhì)疏松和脆性骨折的風(fēng)險增加是衰老的特征表現(xiàn)之一，這一結(jié)果有助于此類骨代謝疾病的研究和治療。

3.3 其他成骨分化轉(zhuǎn)錄因子

許多其他成骨分化轉(zhuǎn)錄因子也被證實在miRNA影響下調(diào)控MSCs成骨分化。SATB2在成骨細(xì)胞形成過程中起著至關(guān)重要的作用，同時它也可以通過提高RUNX2的活性協(xié)同調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖和分化[41]。miR-31被證實可通過靶向SATB2抑制人MSCs成骨分化[42]，同時也可以和RUNX2及SATB2形成調(diào)節(jié)環(huán)影響大鼠骨髓MSCs的成骨分化[33]。DLX基因可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞分化，包括成骨細(xì)胞[43]。Qadir等[44]發(fā)現(xiàn)，miR-124可通過靶向DLX2、DLX3和DLX5抑制體外間充質(zhì)干細(xì)胞(骨髓MSCs、MC3T3-E1和C2C12)成骨分化及體內(nèi)骨形成。

4 miRNA通過靶向成骨信號通路調(diào)節(jié)MSCs成骨分化

在體內(nèi)，骨的發(fā)育和平衡涉及多種信號通路對相關(guān)基因的激活或抑制進(jìn)行緊密調(diào)節(jié)。研究發(fā)現(xiàn)Wnt、BMP、PI3K/Akt、TGF-β、Notch等信號通路均在MSCs成骨分化過程中發(fā)揮重要作用，而這些通路中的關(guān)鍵效應(yīng)分子可受miRNA調(diào)控，進(jìn)而影響骨穩(wěn)態(tài)。

4.1 Wnt信號通路

Wnt信號通路包括β-catenin依賴的經(jīng)典Wnt信號通路和非β-catenin依賴的非經(jīng)典Wnt信號通路(包括Wnt/Ca+通路等)，對包括骨在內(nèi)的機體組織的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要[45]。目前，成骨分化過程的機制研究主要集中于β-catenin依賴的經(jīng)典Wnt信號通路[46]。miR-26a可通過抑制糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3 beta, GSK3β)的表達(dá)激活Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而促進(jìn)骨髓來源的MSCs成骨分化[47]。同時，miR-26a也可通過抑制GSK3β表達(dá)促進(jìn)脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(ASCs)成骨分化[48]。表明miR-26a可通過抑制GSK3β表達(dá)促進(jìn)不同組織來源的MSCs成骨分化。miR-218可通過直接靶向Wnt信號通路的阻遏物分泌脆性相關(guān)蛋2和Dickkopf相關(guān)蛋白2，增強Wnt/β-catenin信號活性從而促進(jìn)人ASCs向成骨分化。而激活Wnt/β-catenin信號通路可促進(jìn)miR-218的表達(dá)，反之則抑制。這種反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)揭示了miRNA可作為信號放大器在成骨分化過程中與信號分子相互作用[49]，有效發(fā)揮其調(diào)節(jié)功能。

近期關(guān)于非經(jīng)典Wnt信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)對成骨細(xì)胞分化影響的研究也越來越多[50]。Li等[51]發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-26a-5p抑制成骨分化，反之則促進(jìn)。Luciferase顯示miR-26a-5p和Wnt家族成員5A(Wnt family member 5A, Wnt5A)的3′UTR結(jié)合。過表達(dá)miR-26a-5p會抑制Wnt5A的表達(dá)，導(dǎo)致Wnt/Ca2+信號通路抑制從而引起鼠來源的ASCs成骨分化減弱。隨后Duan等[52]發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松患者骨組織中miR-16-2*的表達(dá)與骨形成相關(guān)基因(RUNX2、OSTERIX等)呈負(fù)相關(guān)。人骨髓來源MSCs成骨分化過程中miR-16-2*的上調(diào)使成骨分化減弱，而miR-16-2*的下調(diào)則增強了這一過程，Wnt5A是這一過程的直接靶基因。

4.2 BMP信號通路

BMPs是TGF-β超家族的成員，在骨骼發(fā)育和骨組織形成中起著重要作用，BMP信號通路的中斷會導(dǎo)致骨骼形成異常[53]。BMPs家族成員中的BMP2、BMP6、BMP7和BMP9等都可促進(jìn)成骨分化和骨形成，其中BMP2和BMP7已被應(yīng)用于脛骨骨折和脊柱融合的臨床治療[54-55]。

BMP2是最常被研究的BMPs成員之一[56]，可調(diào)控MSCs成骨分化過程中的成骨細(xì)胞成熟階段。Liu等[57]通過體外實驗發(fā)現(xiàn)miR-106b可抑制MSCs成骨分化。miR-106b在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松小鼠模型中表達(dá)升高，而抑制miR-106b的表達(dá)可通過促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收減輕骨質(zhì)疏松對小鼠的不良影響，BMP2是這一過程的直接靶基因。此外，過表達(dá)miR-378可以促進(jìn)BMP2誘導(dǎo)的C2C12細(xì)胞成骨分化[58]，而過表達(dá)miR-370可減弱BMP2誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞成骨分化[59]。

BMP7即成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)-1，在骨組織中表現(xiàn)出較強的合成代謝活性，同時被證實可以促進(jìn)MSCs的成骨分化[60]。軟骨腫瘤特異抑制因子miR-542-3p在美迪紫檀素誘導(dǎo)的成骨分化過程中顯著低表達(dá)。過表達(dá)miR-542-3p可抑制成骨分化，抑制miR-542-3p的表達(dá)則能促進(jìn)成骨細(xì)胞特異性基因的表達(dá)及堿性磷酸酶活性和基質(zhì)礦化。生物信息學(xué)預(yù)測和驗證發(fā)現(xiàn)miR-542-3p和BMP7的3′UTR結(jié)合。另外，動物實驗發(fā)現(xiàn)沉默miR-542-3p的表達(dá)可使卵巢切除小鼠的骨形成、骨密度和骨強度增加[61]。

4.3 PI3K/Akt信號通路

PI3K/Akt是近年來發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和骨形成的一個重要信號通路[14]，已被廣泛證明在MSCs成骨細(xì)胞分化過程發(fā)揮重要作用[62]。Liu等[63]發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑(Vaspin)可抑制MC3T3-E1的成骨分化，此過程同時伴隨miR-34c的顯著性表達(dá)升高及PI3K/Akt信號通路激活。降低miR-34c的表達(dá)，導(dǎo)致Vaspin對成骨分化的抑制作用減弱。而用PI3K/Akt信號通路的特異性阻斷劑處理MC3T3-E1，也可減弱Vaspin的成骨抑制作用同時降低miR-34c的表達(dá)。且降低miR-34c的表達(dá)，反過來可促進(jìn)PI3K/Akt的活化。因此，在MC3T3-E1成骨分化過程中PI3K/Akt和miR-34c構(gòu)成一個回路，控制各自的表達(dá)，這也可能是Vaspin抑制MC3T3-E1成骨細(xì)胞分化的潛在機制。

少數(shù)miRNA被發(fā)現(xiàn)對成骨分化有積極的調(diào)控作用。其中miR-216a在人ASCs細(xì)胞成骨分化過程高表達(dá)。功能實驗及分子信號通路研究表明，miR-216a通過靶向E3泛素蛋白連接酶CBL影響PI3K/Akt通路，拮抗地塞米松對成骨細(xì)胞生成的抑制作用，促進(jìn)體外成骨細(xì)胞分化和體內(nèi)異位骨形成[64]。

5 展 望

miRNA作為核心元件通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子及細(xì)胞內(nèi)信號通路促進(jìn)或抑制MSCs成骨分化，提示可通過靶向核心miRNA選擇性調(diào)控MSCs成骨分化，進(jìn)一步開發(fā)miRNA抑制劑或模擬體藥物，達(dá)到治療成骨細(xì)胞缺乏或功能障礙相關(guān)疾病的目的。同時，大量的研究表明，循環(huán)血液中的miRNA可作為多種人類疾病診斷及預(yù)后判斷等的標(biāo)志物[65-66]，因此MSCs成骨分化相關(guān)的miRNA分泌于體液中也可能作為骨代謝性疾病的標(biāo)志分子，幫助篩選高危人群及早期診斷，達(dá)到預(yù)防及早期治療的目的，降低人群發(fā)病率、患者預(yù)后。當(dāng)前仍需更多的研究工作對此進(jìn)行挖掘和探索。此外，最新的研究已發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA(lncRNA)和環(huán)狀RNA(circRNA)等也在MSCs成骨分化中發(fā)揮重要作用[67-68]，而miRNA可與lncRNA及circRNA形成競爭性內(nèi)源性RNA互作網(wǎng)絡(luò)[69-70]，未來的研究應(yīng)更多關(guān)注這類miRNA競爭模式在MSCs成骨分化中的功能及應(yīng)用價值。