李春琴，鄧寒冰，張粲，金祖敏

腦卒中具有高病死率、高致殘率的特點(diǎn)，患者易出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙致生存質(zhì)量較差［1］。腦卒中患者腦梗死區(qū)免疫細(xì)胞特別是中性粒細(xì)胞可通過(guò)受損血腦屏障移至受損部位，促進(jìn)促炎因子生成，進(jìn)而發(fā)揮免疫防御作用；促炎因子分泌過(guò)?？烧T導(dǎo)免疫級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激等反應(yīng)發(fā)生，影響細(xì)胞功能，從而使疾病加重［2］。因此，減輕腦組織中炎癥反應(yīng)對(duì)于治療腦卒中意義重大。研究顯示，持續(xù)對(duì)腦出血大鼠行針刺治療可減輕其炎癥反應(yīng)，但具體機(jī)制尚不清楚［3］。微小RNA（microRNA，miRNA）在細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)及組織纖維化等方面發(fā)揮重要作用，可影響疾病進(jìn)程。研究顯示，miR-214可通過(guò)調(diào)控第10 號(hào)染色體上磷酸酶和張力蛋白同源缺失的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）及白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達(dá)，影響卒中進(jìn)展［4-5］。針刺是否可影響miR-214及其下游信號(hào)通路水平，從而影響疾病進(jìn)展尚不清楚。因此，本研究建立大鼠腦卒中模型，探究針刺陽(yáng)陵泉、曲池穴位對(duì)腦卒中大鼠炎癥損傷的影響，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色試劑盒、蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一條鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；兔源PTEN、絲蘇氨酸蛋白激酶（threonine protein kinase，AKT）、磷酸化AKT（p-AKT）、核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-6、內(nèi)參GAPDH、LaminB 一抗以及羊抗兔二抗（英國(guó)abcam 公司）；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；康嶺G91-E電針儀（揚(yáng)州康嶺醫(yī)用電子儀器有限公司）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）儀7500（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只SPF級(jí)、45日齡的SD大鼠，雌雄不限，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2017-0033；體質(zhì)量200～220 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心溫度（25±1）℃、濕度（55±5）%、12 h/12 h（光照/黑暗）飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.3 動(dòng)物模型建立與分組 以隨機(jī)數(shù)字表法抽取36 只大鼠，參照文獻(xiàn)［6］以改良Longa 線栓法建立大鼠腦卒中模型，左頸部去鼠毛、消毒，分離出左側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈并結(jié)扎；分離頸動(dòng)脈，于頸內(nèi)動(dòng)脈與頸外動(dòng)脈分叉膨大處切口，尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈切口端并與頸內(nèi)動(dòng)脈一起結(jié)扎。術(shù)后2 h Longa評(píng)分法驗(yàn)證模型情況，36只大鼠卒中模型均成功，以隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組，每組12只。余12只大鼠設(shè)為假手術(shù)組，僅分離頸總動(dòng)脈，不結(jié)扎、不切口、不插線，其余步驟與大鼠腦卒中建立模型相同。

1.4 模型處理 參照文獻(xiàn)［7］中動(dòng)物針灸穴位圖譜并結(jié)合解剖學(xué)方法，根據(jù)穴位走向，針刺組大鼠針刺陽(yáng)陵泉（雙）、曲池（雙），1 次/d，每次留針30 min，留針期間每10 min 行針1 次（頻率：80次/min；捻轉(zhuǎn)角度：180°；持續(xù)時(shí)間：1 min）。陽(yáng)性對(duì)照組采用0.4 mg/kg 尼莫地平溶于1 mL 生理鹽水中灌胃［8］，1次/d，7 d為1個(gè)療程，連續(xù)2個(gè)療程。假手術(shù)組針刺非穴位處作為對(duì)照，假手術(shù)組和模型組灌胃等體積生理鹽水，均干預(yù)14 d。

1.5 Longa評(píng)分評(píng)價(jià)大鼠行為學(xué)情況 5分制神經(jīng)功能缺失評(píng)分：無(wú)神經(jīng)功能癥狀為0 分，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪為1分，爬行時(shí)偏癱側(cè)旋轉(zhuǎn)為2 分，行走時(shí)對(duì)側(cè)傾倒3 分，不能自發(fā)行走為4分，死亡為5分。

1.6 TTC 染色檢測(cè)大鼠腦梗死體積 每組大鼠以隨機(jī)數(shù)字表法抽取4 只取全腦組織置于-20 ℃冰箱中冷凍25 min，腦組織橫切成6 片，0.1%TTC 溶液中37 ℃孵育15 min，10%福爾馬林室溫固定1 h，拍照并用Image-J v1.8.0 軟件分析梗死百分比。梗死區(qū)呈白色，正常腦組織呈紅色。腦梗死體積（%）=白色體積/總體積×100%。其余8只部分大腦冠狀部置于4%多聚甲醛中固定，用于HE 染色，其余置于-80 ℃冰箱備用。

1.7 HE染色觀察大鼠大腦冠狀部情況 每組另外8只部分經(jīng)4%多聚甲醛中固定過(guò)夜后的大腦冠狀部，制備6 μm厚度常規(guī)石蠟切片，按HE染色試劑盒步驟對(duì)切片染色，中性樹膠封片，顯微鏡（×200）拍照觀察大腦冠狀部情況。部分大腦冠狀部行qPCR和蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)。

1.8 qPCR檢測(cè)大腦冠狀部miR-214相對(duì)表達(dá)水平 部分大腦冠狀部研磨充分，miRNA 提取試劑盒提取miRNA，miRNA cDNA第一條鏈合成試劑盒合成cDNA。miR-214引物：上游5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAG-3′，下 游5′-TTAGCCCGCTCAACACT-3′；U6引物：上游5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)體系20 μL：cDNA（50 ng/μL）1 μL、2×Hi SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上游/下游引物（10 μmol/L）1 μL、ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件：94 ℃90 s；95 ℃32 s，61 ℃35 s，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。2-ΔΔCt法對(duì)大腦冠狀部中miR-214表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.9 蛋白免疫印跡檢測(cè)大鼠大腦冠狀部PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6 蛋白表達(dá)情況 各組取部分大腦冠狀部充分研磨，取部分采用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用于檢測(cè)PTEN、AKT、p-AKT、IL-6、GAPDH；其余部分采用相應(yīng)試劑盒提取組織細(xì)胞漿和細(xì)胞核中蛋白用于檢測(cè)細(xì)胞漿中NF-κB 以及細(xì)胞核中NF-κB、LaminB。蛋白定量后行SDSPAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，封閉后加入對(duì)應(yīng)一抗4 ℃過(guò)夜孵育；加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，顯色后拍照片并用Image-J v1.8.0分析灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白灰度值/對(duì)應(yīng)內(nèi)參灰度值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，組內(nèi)處理前后比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠Longa評(píng)分比較 （1）組間比較。建模后處理前，與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組Longa 評(píng)分升高（P＜0.05），而后3 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。處理結(jié)束后，與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組Longa 評(píng)分升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組Longa評(píng)分降低（P＜0.05）。（2）組內(nèi)比較。與建模后處理前比較，處理結(jié)束后針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組Longa評(píng)分降低（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of Longa scores of rats between the four groups表1 4組大鼠處理前后Longa評(píng)分比較（n=12，分，±s）

Tab.1 Comparison of Longa scores of rats between the four groups表1 4組大鼠處理前后Longa評(píng)分比較（n=12，分，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與假手術(shù)組比較，b 與模型組比較，P＜0.05；針刺組與陽(yáng)性對(duì)照組不做比較

組別假手術(shù)組模型組針刺組陽(yáng)性對(duì)照組F建模后處理前0.00±0.00 2.47±0.28a 2.52±0.31a 2.50±0.34a 257.912＊＊處理結(jié)束后0.00±0.00 2.79±0.34a 1.17±0.34ab 1.43±0.28ab 203.353＊＊t 0.000 1.861 2.753＊8.510＊＊

2.2 各組腦梗死體積比較 假手術(shù)組、模型組、針刺組及陽(yáng)性對(duì)照組的腦梗死體積分別占（0.00±0.00）%、（31.46±4.16）%、（16.35±3.14）%、（25.34±3.63）%（n=4，F(xiàn)=74.224，P＜0.05），其中與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組腦梗死體積均增大（P＜0.05）；與模型組相比，針刺組腦梗死體積減?。≒＜0.05），見圖1。

Fig.1 Cerebral infarction of rats in the four groups圖1 4組大鼠腦梗死情況

2.3 各組大鼠大腦冠狀部形態(tài)變化 假手術(shù)組大腦冠狀部完整、清晰，皮層神經(jīng)元細(xì)胞正常、排列整齊；模型組可見皮層神經(jīng)元細(xì)胞排列紊亂，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，纖維化嚴(yán)重；針刺組和陽(yáng)性對(duì)照組皮層神經(jīng)元細(xì)胞排列較紊亂，炎癥和纖維化現(xiàn)象減輕，見圖2。

Fig.2 Morphological comparison of the coronary region of rat brain in the four groups(HE staining,×200)圖2 4組大鼠大腦冠狀部形態(tài)學(xué)比較（HE染色，×200）

2.4 電針對(duì)大鼠大腦冠狀部miR-214相對(duì)表達(dá)水平的影響 假手術(shù)組、模型組、針刺組及陽(yáng)性對(duì)照組的大腦冠狀部miR-214相對(duì)表達(dá)水平分別為（1.00±0.21）、（2.13±0.46）、（1.56±0.35）、（1.61±0.32），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（n=8，F(xiàn)=14.207，P＜0.05），其中與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組大腦冠狀部中miR-214水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組大腦冠狀部中miR-214水平降低（P＜0.05），而后2組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 電針對(duì)大鼠大腦冠狀部PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6 的影響 與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組大腦冠狀部中PTEN，模型組細(xì)胞漿中NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），模型組大腦冠狀部中p-AKT/AKT、IL-6，陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞漿中NF-κB，模型組、陽(yáng)性對(duì)照組細(xì)胞核中NFκB 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與模型組比較，針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組大腦冠狀部中PTEN、p-AKT/AKT、細(xì)胞漿NF-κB 蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高，細(xì)胞核NF-κB、IL-6 蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖3、表2。

3 討論

腦卒中屬傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，為風(fēng)痰瘀阻、痰熱腑實(shí)、氣虛血瘀、陰虛風(fēng)動(dòng)等證型［9］。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)根據(jù)其發(fā)病機(jī)制，通常采用活血化瘀、熄風(fēng)化痰、通腑瀉火方案治療該病。針刺穴位有行氣活血、舒經(jīng)活絡(luò)功效，可改善局部病灶處血液循環(huán)，抑制炎癥，緩解炎癥反應(yīng)［10-11］。其中，陽(yáng)陵泉?dú)w于足少陽(yáng)經(jīng)合土穴，屬八會(huì)穴之一，有舒筋通絡(luò)、通經(jīng)止痛功效；在治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎中可改善局部微循環(huán)，增加血液供應(yīng)，從而達(dá)到清除致痛物質(zhì)的目的［12］。曲池屬手陽(yáng)明大腸經(jīng)合穴，有激發(fā)經(jīng)氣之功效；在治療過(guò)敏性鼻炎中可增加抗炎作用，減少巨噬細(xì)胞和T 淋巴細(xì)胞的分泌，促進(jìn)局部致病因子分解，減少疼痛，亦可抑制毛細(xì)血管通透性增加［13］。本研究中，與假手術(shù)組比較，模型組、針刺組、陽(yáng)性對(duì)照組Longa 評(píng)分升高，表明大鼠出現(xiàn)神經(jīng)損傷情況，提示造模成功；模型組腦梗死體積增大，大鼠大腦冠狀部出現(xiàn)明顯的炎癥損傷和纖維化現(xiàn)象，提示腦卒中可致血液供應(yīng)不足，促使冠狀部發(fā)生炎癥反應(yīng)和纖維化，導(dǎo)致腦梗死發(fā)生。與模型組比較，針刺組Longa 評(píng)分降低，提示針刺可緩解大鼠神經(jīng)損傷。針刺組腦梗死體積減小，大腦冠狀部炎癥減弱，提示針灸通過(guò)疏經(jīng)通絡(luò)等作用可改善局部微循環(huán)及血液循環(huán)，從而促進(jìn)部分梗死區(qū)域供血，恢復(fù)其功能，同時(shí)亦可改善炎癥現(xiàn)象，達(dá)到緩解疾病目的，但具體機(jī)制尚不明確。

miRNA 具有多重功能，高度保守且具有細(xì)胞特異性，可調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程，從而調(diào)控基因表達(dá)，影響其功能。其中，miR-214位于1 號(hào)染色體長(zhǎng)臂（1q24.3）鈣離子重吸收相關(guān)基因Dnm3 基因內(nèi)，影響皮層神經(jīng)元、大腦皮層發(fā)育以及胚胎干細(xì)胞神經(jīng)分化，從而影響神經(jīng)發(fā)育和再生［14］。對(duì)小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型的研究顯示，隨著病情加重，miR-214水平升高并加重了骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷［15］。而miR-214可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和上調(diào)炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 表達(dá)水平［16］，但具體機(jī)制并不明確。有研究顯示，miR-214可通過(guò)靶向PTEN 來(lái)影響下游AKT/NF-κB/IL-6 信號(hào)通路的表達(dá)而發(fā)揮作用，進(jìn)而影響細(xì)胞增殖、凋亡，及炎性因子表達(dá)水平［17-18］。另有研究顯示，潰瘍性結(jié)腸炎小鼠miR-214表達(dá)水平升高，PTEN表達(dá)水平降低，PTEN對(duì)AKT的抑制作用降低，導(dǎo)致AKT水平升高，進(jìn)而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB 分泌，上調(diào)IL-6、IL-1β、TNF-α等，發(fā)揮促炎作用［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組比較，模型組大腦冠狀部miR-214水平升高，p-AKT/AKT、細(xì)胞核NF-κB 和IL-6 蛋白水平升高，PTEN、細(xì)胞漿NF-κB 蛋白水平降低，表明腦卒中后miR-214水平升高可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加重以及相關(guān)蛋白表達(dá)水平的改變，提示腦卒中大鼠大腦冠狀部中miR-214水平異常升高后可能抑制PTEN表達(dá)，使PTEN 對(duì)AKT 的抑制作用減弱，AKT 活化水平升高，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB由胞漿進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)促炎因子的分泌，加重炎癥反應(yīng)及神經(jīng)損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，針刺組miR-214水平降低，p-AKT/AKT、IL-6、細(xì)胞核NF-κB 蛋白水平亦降低，而PTEN、細(xì)胞漿NF-κB 蛋白水平升高，提示針刺可降低miR-214水平，而miR-214水平降低減弱對(duì)PTEN的抑制作用，促進(jìn)PTEN水平升高，PTEN水平升高則加強(qiáng)對(duì)AKT 的抑制作用，AKT 受到抑制，從而降低轉(zhuǎn)錄因子NF-κB由胞漿進(jìn)入細(xì)胞核過(guò)程，減少炎性因子分泌，減緩炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦卒中大鼠腦組織的保護(hù)。

Fig.3 Protein levels of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 in the coronary region of rat brain in the four groups圖3 4組大鼠大腦冠狀部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平

Tab.2 Comparison of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 protein levels in coronary region of rat brain between the four groups表2 4組大鼠大腦冠狀部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平比較 （n=8，±s）

Tab.2 Comparison of PTEN,AKT,p-AKT,NF-κB and IL-6 protein levels in coronary region of rat brain between the four groups表2 4組大鼠大腦冠狀部中PTEN、AKT、p-AKT、NF-κB、IL-6蛋白水平比較 （n=8，±s）

＊＊P＜0.01；a與假手術(shù)組比較，b與模型組比較，P＜0.05；針刺組與陽(yáng)性對(duì)照組不做比較

組別假手術(shù)組模型組針刺組陽(yáng)性對(duì)照組F PTEN 1.36±0.28 0.21±0.06a 0.89±0.14ab 0.95±0.21ab 49.876＊＊AKT 0.83±0.12 0.84±0.15 0.82±0.14 0.84±0.15 0.037 p-AKT/AKT 0.93±0.15 1.53±0.18a 0.96±0.17b 1.06±0.15b 23.421＊＊組別假手術(shù)組模型組針刺組陽(yáng)性對(duì)照組F NF-κB細(xì)胞漿0.74±0.11 0.09±0.02a 0.78±0.05b 0.86±0.05ab 230.690＊＊細(xì)胞核0.26±0.04 0.90±0.12a 0.21±0.05b 0.41±0.05ab 151.213＊＊IL-6 0.15±0.01 0.86±0.12a 0.12±0.03b 0.21±0.05b 221.497＊＊

綜上所述，針刺腦卒中大鼠可減輕其腦組織炎癥損傷，可能是通過(guò)抑制miR-214水平及下游PTEN/AKT/NF-κB/IL-6 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的；但miR-214影響的通路較多，亦可能影響別的通路，實(shí)現(xiàn)對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)，需在進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn)其機(jī)制。