陸璐，余慧萍，成建

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。宮頸脫落細胞的細胞學檢查在宮頸癌篩查中至關重要，是目前國內(nèi)外宮頸癌篩查指南中不可或缺的方法。未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）是伯塞斯達系統(tǒng)（TBS）分類法中最常見的細胞學病變描述，其細胞改變程度較反應性改變細胞明顯，且有進展為宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅱ級或Ⅲ級等高度鱗狀上皮內(nèi)病變的可能［1］,故對ASCUS 患者進行及時有效地評價和分流管理，有利于患者的診治和預后。

2016 年美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會推薦的宮頸癌篩查及預防指南建議將高危型人乳頭瘤病毒（HPV）DNA檢測結果作為ASCUS人群主要的分流依據(jù)，即HPV DNA 陽性者行陰道鏡檢查［2］。但是，由于HPV感染具有一過性的特點，單純HPV DNA檢測可能出現(xiàn)假陽性結果，造成長期過密的隨訪和不必要的陰道鏡檢查。HPV E6/E7 mRNA檢測是近年來興起的一種新型檢測技術，可以檢測高危型HPV E6/E7 癌基因的mRNA表達情況。該檢測方法能較好地反映癌基因的活動度，更好地預測宮頸病變的風險［3］，因此逐漸應用于臨床宮頸癌篩查。目前已有較多研究對HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測技術在宮頸癌篩查中的診斷準確性進行對比分析，但針對兩者在ASCUS人群分流中應用價值的比較研究尚少見。本研究對關于HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測對ASCUS人群分流價值的診斷研究進行Meta分析，以期為臨床優(yōu)化ASCUS 患者的分流處理提供循證醫(yī)學證據(jù)。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：（1）國內(nèi)外公開發(fā)表的關于HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA檢測對ASCUS人群分流價值的診斷研究。（2）研究中有宮頸HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測的結果。（3）以病理組織學診斷為金標準。（4）有完整的原始數(shù)據(jù)，能直接或間接獲得篩查試驗的真陽性值（TP）、假陽性值（FP）、假陰性值（FN）、真陰性值（TN）。排除標準：（1）樣本量≤60例。（2）無病理結果。（3）數(shù)據(jù)不完整、不能獲得完整資料的文獻。（4）綜述、重復報道、會議內(nèi)容等。

1.2 文獻檢索策略 采用主題詞和自由詞相結合的方式，分別以宮頸、人乳頭瘤病毒、未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮 細 胞、HPV、mRNA 為 中 文 檢 索詞，以cervical、human papillomavirus、HPV、mRNA、E6/E7、ASCUS為英文檢索詞，檢索MEDLINE、EMbase、Cochrane Library、Web of Science、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫和中國知網(wǎng)（CNKI）等數(shù)據(jù)庫，并采用文獻追溯等方法搜集關于HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測對ASCUS 人群分流診斷價值的研究。語言限制為中、英文。檢索時限為2010年1月1日—2019年12月31日。

1.3 文獻篩選及數(shù)據(jù)提取 由2 位研究者分別獨立根據(jù)納入與排除標準篩選文獻。首先，閱讀文題和摘要，剔除重復、不符合納入與排除標準的文獻，對于部分重復發(fā)表或數(shù)據(jù)有重疊現(xiàn)象的文獻，選取樣本量最大、最近發(fā)表或信息最詳細者；其次，對可能納入的文獻進一步閱讀全文并交叉核對結果；最后，對存在異議的文獻，則研究小組討論決定是否納入。對納入文獻提取以下數(shù)據(jù)資料：（1）研究的基本信息，包括第一作者、發(fā)表時間、國家等。（2）研究對象的基本特征，包括樣本量、年齡等；HPV mRNA和HPV DNA檢測選用試劑盒的檢測原理，如HPV mRNA 檢測選用PreTect HPV-Proofer、APTIMATM等試劑盒檢測原理；HPV DNA 檢測選用第二代雜交捕獲法（Hybrid Capture 2，HCⅡ）或PCR 反向雜交等原理。（3）偏倚風險評價的關鍵要素，包括病例選擇（Patient Selection）、待評價試驗（Index Test）、金標準（Reference Standard）及病例流程和進展情況（Flow and Timing）4個部分。（4）實驗原始數(shù)據(jù)，直接獲取或計算得出TP、FP、FN、TN。

1.4 納入研究的偏倚風險評價 采用RevMan 5.3 軟件中的診斷性試驗準確性質(zhì)量評價工具-2（QUADAS-2）對納入研究進行偏倚風險評價。由2名評價者根據(jù)標準獨立評價，如遇分歧，則研究小組討論協(xié)商。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用Meta-Disc 1.4軟件檢測異質(zhì)性，包括閾值效應和非閾值效應引起的異質(zhì)性及異質(zhì)性來源。采用敏感度對數(shù)與（1-特異度）對數(shù)的Spearman 相關系數(shù)檢驗是否存在閾值效應，P≥0.05表示不存在閾值效應。以診斷比值比（DOR）為效應量，對不同檢測方法的DOR 進行Cochrane-Q 檢驗，檢測水準α=0.1，同時結合I2判斷異質(zhì)性大小。當P＞0.1和I2≤50%，無異質(zhì)性，采用固定效應模型進行Meta 分析；當P≤0.1或I2＞50%，存在異質(zhì)性，則進一步分析異質(zhì)性來源，采用隨機效應模型進行Meta 分析。計算HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測合并的敏感度（SEN）、特異度（SPE）、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）及其95%CI。采用線性模型擬合受試者工作特征（SROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），AUC 越接近1，認為診斷價值越高。采用Stata 12.1軟件，以Egger線性回歸法對納入文獻進行偏倚檢測，采用標準正態(tài)離差（standard normal deviate，SND）對效應估計值的精確度（precision）作回歸分析。SND 的定義為OR與其標準誤（SE）的比值，精確度的定義為SE的倒數(shù)。P＞0.05提示不存在發(fā)表偏倚。

2 結果

2.1 文獻篩選流程及結果 初檢出相關文獻1 536篇。經(jīng)剔除重復文獻，閱讀摘要及全文后，按照納入、排除標準進一步篩選，最終納入文獻15篇，包括ASCUS患者4 019例。文獻篩選流程及結果見圖1。納入研究的基本特征見表1。

Fig.1 Flow diagram of screening articles圖1 文獻篩選流程圖

2.2 所納入的研究偏倚風險評價結果 15 項研究均說明了納入研究對象的條件，其中5 項未能避免不恰當?shù)呐懦?5項研究均對研究對象進行宮頸活檢，7項研究采用了盲法，具有可靠的金標準；6項研究描述了初步篩查與陰道鏡活檢的時間間隔。各研究的偏倚風險評價結果見圖2。

2.3 異質(zhì)性分析結果 HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測的Spearman 相關系數(shù)rs分別為0.222（P=0.427）和0.466（P=0.080），提示不存在閾值效應。Q檢驗顯示，研究人群中HPV mRNA檢測的Cochrane-Q 為23.610，P=0.051，I2=40.7%；HPV DNA 檢測的Cochrane-Q 為28.570，P=0.012，I2=51.0%，提示各研究結果間存在統(tǒng)計學異質(zhì)性。

Fig.2 Risk assessment of bias in included studies圖2 納入研究的偏倚風險評價

Tab.1 The basic characteristics of included studies表1 納入文獻的的基本研究特征

2.4 亞組分析與Meta 回歸分析結果 將HPV E6/E7 mRNA 檢測和HPV DNA 檢測分別按樣本量、檢測原理進行亞組分析。結果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測研究間的異質(zhì)性可能與檢測原理有關，HPV E6/E7 mRNA 檢測和HPV DNA 檢測研究間的異質(zhì)性可能與樣本量有關，見表2。Meta 回歸分析結果顯示，2種檢測方法異質(zhì)性來源與以上2種變量無明顯相關性（均P＞0.05），見表3。

2.5 Meta 分析結果 異質(zhì)性分析結果顯示，HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 各研究結果間存在統(tǒng)計學異質(zhì)性（I2分別為40.7%、51.0%，均P≤0.01），經(jīng)異質(zhì)性分析處理后，仍無法消除，故選擇隨機效應模型合并統(tǒng)計量。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 在ASCUS人群檢出CINⅡ+合并的SEN、SPE、PLR、NLR 及其95%CI見表4，其診斷比值比的Meta 分析結果見圖3、4。建立匯總受試者SROC 曲線，2 種檢測方法檢出CINⅡ+的AUC 分別為0.847 和0.760，見圖5、6。結果顯示，除SEN 外，HPV E6/E7 mRNA 檢測在ASCUS 人群檢出CINⅡ+的宮頸病變的診斷效能優(yōu)于HPV DNA檢測。

2.6 發(fā)表偏倚評估 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA各研究均不存在明顯的發(fā)表偏倚（P分別為0.134和0.163），見圖7。

Tab.2 Subgroup analysis results of included studies表2 納入研究異質(zhì)性的亞組分析結果

Tab.3 Meta regression analysis results of two detection methods表3 2種檢測方法的Meta回歸分析結果

Tab.4 Combined results of the two test methods表4 2種檢測方法的合并診斷效能

3 討論

美國癌癥學會（ACS）發(fā)布的“全球癌癥統(tǒng)計2018”顯示，在全球185 個國家的860 萬例女性癌癥新發(fā)病例及420 萬癌癥死亡病例中，宮頸癌的發(fā)病率（6.6%）、死亡率（7.5%）均排名第4 位［19］。2019 年中國國家癌癥中心發(fā)布的全國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2015 年我國宮頸癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第6位，死亡率位居女性惡性腫瘤第8 位。普及防癌知識，開展宮頸癌篩查，做到早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可以有效降低宮頸癌的發(fā)病率、死亡率，尤其是在經(jīng)濟衛(wèi)生條件相對落后的農(nóng)村地區(qū)。宮頸脫落細胞的細胞學檢測是目前宮頸癌篩查策略的基礎，按照現(xiàn)有的篩查策略，臨床醫(yī)師會建議細胞病理診斷為ASCUS的患者進一步接受HPV檢測。

目前研究一致認為，宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展與高危型HPV 的感染有關［20］。但女性一生中感染HPV 的概率高達80%，其中絕大部分感染是一過性的，2～3年可被自身免疫清除，超過91%的ASCUS及低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）患者HPV 感染在6～24 個月自動清除［21］。在宮頸上皮細胞癌變過程中，HPV 需將其E6/E7 DNA 整合入宮頸上皮細胞基因組中，轉(zhuǎn)錄生成E6/E7癌蛋白，兩者分別與抑癌蛋白p53和pRb結合，干擾細胞周期調(diào)節(jié)，導致細胞無限分裂最終引起癌變［22］。E6/E7 mRNA 正是病毒癌基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，其在宮頸上皮細胞的過度表達是導致宮頸癌的關鍵因素［23］。

Fig.3 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV E6/E7 mRNA test圖3 HPV E6/E7 mRNA檢測診斷比值比的Meta分析

Fig.4 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV DNA test圖4 HPV DNA檢測診斷比值比的Meta分析

Fig.5 SROC curve of HPV E6/E7 mRNA diagnosis for CINⅡ+in research objects圖5 研究對象中HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CINⅡ+的SROC曲線

Fig.6 SROC curve of HPV DNA diagnosis for CINⅡ+in research objects圖6 研究對象中HPV DNA檢測診斷CINⅡ+的SROC曲線

Fig.7 Funnel plots for assessment in published literature圖7 發(fā)表偏倚評估漏斗圖

近年來，文獻報道了HPV E6/E7 mRNA 檢測在ASCUS人群中的分流診斷價值，但與HPV DNA檢測相比，其診斷效能仍存爭議。本研究共納入15項研究，共計4 019 例患者，系統(tǒng)比較2 種檢測方法對ASCUS 人群的分流診斷價值。Meta 分析結果顯示，與HPV DNA 檢測相比，HPV E6/E7 mRNA 檢測的合并敏感度低、特異度高，提示其在ASCUS 人群中檢出CINⅡ+的價值優(yōu)于HPV DNA檢測，這與國外一篇薈萃分析［24］結論一致，分析其原因可能與2 種檢測方法的檢測原理有關。HPV DNA 檢測是對宿主細胞內(nèi)游離狀態(tài)與整合狀態(tài)的HPV DNA進行檢測，無法判斷HPV感染階段和病毒癌基因的活性情況；而HPV mRNA檢測僅檢測整合狀態(tài)的病毒RNA片段，大大降低了假陽性出現(xiàn)的概率。同時，根據(jù)SROC曲線，2種檢測方法的AUC 分別為0.847和0.760，提示HPV E6/E7 mRNA 檢測的診斷效能優(yōu)于HPV DNA檢測，有望成為ASCUS患者分流的一種更為有效的檢測方法。此外，HPV E6/E7 mRNA 檢測的陽性似然比高于HPV DNA 檢測，分別為2.40 和1.59，提示E6/E7 mRNA 陽性的ASCUS 患者較HPV DNA陽性者更易出現(xiàn)CINⅡ+病變。因此，對于HPV E6/E7 mRNA 陽性的ASCUS 患者，應引起警惕，并采取更積極的治療方案，從而改善患者的臨床結局；但HPV E6/E7 mRNA檢測敏感度低可能會引起一定的漏診，并且國內(nèi)外對其定量檢測的最佳診斷臨界點尚存爭議［25］。因此，在細胞學檢查的基礎上，開展HPV E6/E7 mRNA 檢測對ASCUS 人群進行分流，尚需高質(zhì)量、大樣本的臨床數(shù)據(jù)支持。臨床上應對各項HPV 檢測技術進行客觀、科學的評價，并結合中國醫(yī)療現(xiàn)狀，制定出適應我國國情的宮頸癌篩查策略。

在異質(zhì)性分析時，亞組分析結果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測研究間的異質(zhì)性可能與檢測原理的差異有關；而HPV DNA檢測研究間的異質(zhì)性可能與研究樣本量有關。通常小樣本研究可能會呈現(xiàn)更好的診斷準確性，納入研究的檢測原理不同、選擇試劑盒的差異甚至檢測儀器的不同，均會引起測量偏倚，導致異質(zhì)性的出現(xiàn)。由于本研究進行Meta 回歸時未能找出異質(zhì)性的主要來源，故影響結果的準確性。本研究尚有一定局限性：（1）納入的研究僅為中、英文文獻，其他語種文獻未能納入。（2）部分納入的研究質(zhì)量不高，未提及是否使用盲法。（3）納入的研究檢測原理不盡相同，雖進行了亞組分析，但異質(zhì)性仍無法消除，可能與研究設計不同、研究對象的種族年齡存在差異有關。

綜上所述，對于ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測在診斷CINⅡ+的宮頸病變中，均具有一定的診斷價值，HPV E6/E7 mRNA 檢測的診斷效能優(yōu)于HPV DNA 檢測，尤其是其檢測特異度較高。由于納入研究的對象和質(zhì)量有限，上述結論仍有待進一步研究驗證。