韓崇明，張瑩瑩，徐兆龍△

對比劑誘發(fā)的急性腎損傷，即對比劑腎?。╟ontrast induced nephropathy，CIN），是導致醫(yī)院獲得性急性腎損傷的第三大原因，可發(fā)生于30%以上接受碘化對比劑注射的患者［1］。CIN 的病理機制包括腎小管和血管內皮細胞的直接毒性作用、血流動力學紊亂、氧化應激等［2］。然而，其確切的發(fā)病機制仍不清楚，故缺乏有效的預防和治療方法。常規(guī)的抗氧化劑和堿性療法對有腎臟并發(fā)癥的對比劑腎病患者并無增益［3］。

近期有研究提出，對比劑腎病可能是由原位或浸潤的巨噬細胞和腎小管上皮細胞間相互作用導致的［4］，但是2種細胞間具體的通訊方式尚不清楚。外泌體是一種攜帶蛋白質、微小RNA等活性成分的脂質雙層囊泡，作為一種新的細胞間通訊方式而成為近年的研究熱點［5-6］。在高糖誘導的糖尿病腎病模型中，腎小管上皮細胞可通過外泌體誘導巨噬細胞激活，巨噬細胞來源的外泌體也可促進系膜細胞增殖和活化，表明外泌體在腎臟細胞間是一種普遍且關鍵的通訊方式。但是在對比劑腎病中，外泌體在腎臟細胞間的作用尚鮮見報道。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種非組蛋白染色體結合蛋白，在細胞受到外界刺激時，可由巨噬細胞等炎性細胞分泌至胞外。本研究采用對比劑體外誘導巨噬細胞，分離獲得外泌體，從而觀察其對腎小管上皮細胞功能的影響，并初步探討HMGB1在外泌體中的表達以及特異性阻斷藥物甘草酸苷的干預效應。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人腎小管上皮細胞株HK-2細胞、人急性單核細胞白血病細胞株THP-1 細胞購自美國菌種保藏中心（ATCC）；無外泌體的胎牛血清、青鏈霉素、RMPI-1640培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Hyclone 公司；碘海醇購自通用電氣藥業(yè)上海有限公司；甘草酸苷、佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）購自美國Sigma 公司；ExoQuick-TC Kit 外泌體提取試劑盒購自美國Systems Biosciences 公司；BCA 蛋白定量試劑盒、膜聯蛋白（Annexin）Ⅴ-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；外泌體標記試劑盒購自遼寧潤基生物科技有限公司；DAPI購自北京中杉金橋生物技術有限公司；Trizol試劑購自德國Qiagen 公司；PrimeScriptTM反轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司；兔抗CD63 抗體、兔抗TSG101 抗體、兔抗calnexin 抗體、小鼠抗HMGB1抗體、兔抗Toll樣受體4（TLR4）抗體、兔抗核因子κB（NF-κB）抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax抗體、兔抗Cleaved caspase-3抗體、小鼠抗GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；引物合成于蘇州金唯智生物科技有限公司。BX-63熒光顯微鏡購自日本Olympus公司；H-7500 透射電子顯微鏡購自日本Hitachi 公司；FACS Calibur 流式細胞儀購自美國BD 公司；Gel Doc XR 凝膠成像儀和CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 外泌體的分離與鑒定 THP-1 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%無外泌體的胎牛血清、1%青鏈霉素的RMPI-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的恒溫箱中。細胞用含100 nmol/L PMA的完全培養(yǎng)基誘導貼壁24 h。PBS 洗滌2 次后，更換為無血清的RMPI-1640 培養(yǎng)基，分別加入PBS、碘海醇（100 gI/L）、碘海醇+甘草酸苷（10 μmol/L）刺激24 h，收集細胞培養(yǎng)上清液，4 ℃、6 000 r/min離心20 min，上清液經0.22 μm濾器過濾后，采用ExoQuick-TC Kit 外泌體提取試劑盒分離外泌體。適量PBS重懸外泌體沉淀后，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，保存于-80 ℃冰箱。獲得的3 種外泌體分別記為NC-Exo、CIN-Exo、CIN-GL-Exo。外泌體的鑒定［7-8］：采用透射電鏡觀察外泌體的形態(tài)；采用蛋白免疫印跡（Western blot）檢測CD63、TSG101、calnexin 的表達，一抗分別為兔抗CD63抗體、兔抗TSG101 抗體、兔抗calnexin 抗體，稀釋比例均為1∶1 000。

1.3 外泌體的攝取 HK-2 細胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%無外泌體的胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，將HK-2細胞按照2×104個/孔接種至24 孔板。采用外泌體標記試劑盒對外泌體進行DiR 熒光標記，加入50 μg/L已標記外泌體至培養(yǎng)的HK-2細胞中。共培養(yǎng)24 h后，常規(guī)進行多聚甲醛固定和DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.4 實驗分組 將培養(yǎng)的HK-2 細胞隨機分為4 組，Con 組（加入等體積的PBS）、NC-Exo 組（加入50 μg/L 的NC-Exo）、CIN-Exo組（加入50 μg/L的CIN-Exo）、CIN-GL-Exo組（加入50 μg/L的CIN-GL-Exo）。

1.5 檢測指標

1.5.1 Western blot 檢測相關蛋白的表達 Western blot 檢測3種外泌體中HMGB1表達量，以及4組細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-3 及HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白的表達。收集1×106個細胞，加入100 μL 的RIPA 裂解液，充分裂解2 min，12 000 r/min 離心10 min，留取上清液，進行BCA蛋白定量。樣本經10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，然后將蛋白電轉膜至PVDF膜，加入5%的脫脂奶粉常溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜孵育，一抗分別為小鼠抗HMGB1 抗體、兔抗TLR4 抗體、兔抗NF-κB 抗體、兔抗Bcl-2抗體、兔抗Bax 抗體、兔抗Cleaved caspase-3 抗體、小鼠抗GAPDH 抗體，孵育濃度均為1∶1 000。次日，漂洗3 次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，漂洗3 次，經ECL顯色后，用凝膠成像儀拍照。采用Image J 軟件測量各條帶的灰度值，將Con 組目的蛋白與內參蛋白GAPDH 的灰度值之比作為1，每組10 個樣本，每個樣本設置3 個復孔，取其平均值。

1.5.2 流式細胞術檢測4 組細胞的凋亡率 收集1×106個細胞，根據Annexin Ⅴ-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒說明書進行操作：加入500 μL Binding Buffer 重懸細胞，添加5 μL AnnexinⅤ-FITC混勻，然后再加入5 μL Propidium Iodide，混勻，室溫下避光反應5～15 min，流式細胞儀上檢測，每份樣品收集1×104個細胞。Annexin Ⅴ-FITC 與PI 染色雙陽性的細胞為晚期凋亡細胞。凋亡率=晚期凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.5.3 實時熒光定量PCR（qPCR）檢測4 組細胞炎性因子白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-αmRNA 的表達 用Trizol 試劑提取細胞中mRNA。PrimeScriptTM反轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA，反應條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃，30 min。采用SYBR?Premix Ex TaqⅡ試劑盒進行qPCR，引物序列，見表1。反應條件：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，40 個循環(huán)。按照2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，每組10個樣本，每個樣本設置3個復孔，取其平均值。

Tab.1 Primer sequences for qPCR表1 qPCR引物序列

1.6 統計學方法 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外泌體的鑒定 透射電鏡觀察顯示，THP-1細胞來源的外泌體為圓形或類圓形小囊泡，見圖1A。Western blot 檢測結果顯示，外泌體中含有表面標志物蛋白CD63、TSG101，而不含有內質網蛋白calnexin，見圖1B。

Fig.1 Identification of exosomes圖1 外泌體的鑒定

2.2 外泌體的攝取 熒光染色結果顯示，標記DiR熒光素的外泌體可被HK-2 細胞攝取，聚集于核膜附近，見圖2。

Fig.2 The uptake of exosomes圖2 外泌體的攝取

2.3 3 種外泌體中HMGB1 表達量的比較 Western blot 結果顯示，CIN-Exo 的HMGB1 蛋白表達量（4.72±0.45）高 于NC-Exo（1.00±0.23）和CIN-GLExo（0.82±0.27），差異有統計學意義（F=531.500，P＜0.01），見圖3。

2.4 4 組細胞凋亡情況的比較 Annexin Ⅴ-FITC/PI 雙染結果顯示，CIN-Exo 組的細胞凋亡率［（20.38±2.54）%］高于Con 組［（3.73±0.76）%］、NCExo 組［（8.41±1.09）%］和CIN-GL-Exo 組［（10.50±1.27）%］，差異有統計學意義（F=240.200，P＜0.01），見圖4。Western blot 結果顯示，NC-Exo 組細胞Bcl-2 表達量低于Con 組，而Bax、Cleaved caspase-3 表達量高于Con組（P＜0.05）；CIN-Exo組細胞Bcl-2表達量低于Con 組、NC-Exo 組、CIN-GL-Exo 組，而Bax、Cleaved caspase-3 表 達 量 高 于Con 組、NC-Exo 組、CIN-GL-Exo組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖5、表1。

Fig.3 The protein expression of HMGB1 in exosomes detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測外泌體中HMGB1蛋白質的表達

Fig.4 The apoptosis rates of cells detected by Annexin Ⅴ-FITC/PI double staining method圖4 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法檢測4組細胞凋亡率

Fig.5 The expression of apoptosis-related protein detected by Western blot assay圖5 Western blot檢測細胞中凋亡相關蛋白的表達

Tab.1 Comparison of the expression levels of apoptosisrelated proteins between 4 groups of cells表1 4組細胞凋亡相關蛋白表達水平的比較（n=12，±s）

Tab.1 Comparison of the expression levels of apoptosisrelated proteins between 4 groups of cells表1 4組細胞凋亡相關蛋白表達水平的比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與Con 組比較，b與NC-Exo 組比較，c與CIN-Exo 組比較，P＜0.05

組別Con組NC-Exo組CIN-Exo組CIN-GL-Exo組F Bcl-2 1.00±0.19 0.58±0.23a 0.27±0.11ab 0.54±0.20ac 30.940＊Bax 1.00±0.15 1.93±0.27a 4.48±0.43ab 2.30±0.36abc 254.300＊Cleaved caspase-3 1.00±0.14 2.02±0.31a 3.97±0.46ab 1.88±0.35ac 167.400＊

2.5 4 組細胞炎性因子mRNA 相對表達水平的比較 NC-Exo組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表達水平高于Con組（P＜0.05）；CIN-Exo組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 表達水平高于Con 組、NCExo 組、CIN-GL-Exo 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels ofinflammatory factors between 4 groups of cells表2 4組細胞炎性因子mRNA表達水平的比較（n=12，±s）

Tab.2 Comparison of the mRNA expression levels ofinflammatory factors between 4 groups of cells表2 4組細胞炎性因子mRNA表達水平的比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與Con 組比較，b與NC-Exo 組比較，c與CIN-Exo 組比較，P＜0.05

組別Con組NC-Exo組CIN-Exo組CIN-GL-Exo組F IL-1β 1.00±0.14 1.59±0.22a 4.36±0.48ab 2.04±0.37abc 238.700＊IL-6 1.00±0.16 1.38±0.25a 3.50±0.41ab 1.46±0.39ac 149.600＊TNF-α 1.00±0.11 1.80±0.26a 4.93±0.55ab 2.26±0.41abc 253.000＊

2.6 4 組細胞HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白表達水平的比較 Western blot 結果顯示，NCExo 組細胞HMGB1、TLR4、NF-κB 表達量高于Con組（P＜0.05）；CIN-Exo 組細胞HMGB1、TLR4、NFκB 表達量高于Con 組、NC-Exo 組、CIN-GL-Exo 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3、圖6。

Tab.3 Comparison of the expression levels of HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins between 4 groups of cells表3 4組細胞HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的比較（n=12，±s）

Tab.3 Comparison of the expression levels of HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway related proteins between 4 groups of cells表3 4組細胞HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達水平的比較（n=12，±s）

＊P＜0.05；a與Con 組比較，b與NC-Exo 組比較，c與CIN-Exo 組比較，P＜0.05

組別Con組NC-Exo組CIN-Exo組CIN-GL-Exo組F HMGB1 1.00±0.18 2.17±0.34a 3.03±0.45ab 1.95±0.29ac 76.820＊TLR4 1.00±0.22 2.48±0.29a 4.79±0.53ab 2.26±0.30ac 237.800＊NF-κB 1.00±0.17 2.25±0.26a 4.50±0.58ab 2.49±0.31ac 190.500＊

Fig.6 The expression of HMGB1/TLR4/NF-κB signaling pathway detected by Western blot assay圖6 Western blot檢測細胞中HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的表達

3 討論

近期有研究發(fā)現，原位或浸潤的巨噬細胞可能在對比劑腎病中發(fā)揮關鍵作用［4］。循環(huán)中的對比劑被原位巨噬細胞攝取后，使Nod 樣受體蛋白3（NLRP3）炎性體激活，大量生成并分泌IL-1β 等炎性因子，從而介導循環(huán)中的白細胞向腎臟遷移；另一方面，對比劑經腎小球過濾后進入腎小管，然后由腎小管上皮細胞重吸收后，再遞送給巨噬細胞，使炎癥反應進一步擴大。由此可見，巨噬細胞、腎小管上皮細胞等不同類型細胞間緊密聯系，在腎損傷中發(fā)揮協同效應，但是細胞間通訊方式尚不清楚。外泌體是一種雙層質膜包裹的囊泡樣小體，直徑為50～150 nm，可由大多數細胞分泌［9-10］。外泌體中包含著豐富的蛋白質、脂質、微小RNA等活性成分，可將重要的信號分子遞送至靶細胞，從而發(fā)揮各種調節(jié)作用［11］。在對糖尿病腎病的研究中發(fā)現，血管內皮細胞來源的外泌體可以激活腎小球系膜細胞，促進細胞外基質的分泌，而且腎小球系膜細胞來源的外泌體也可介導足細胞損傷［12-14］。因此，筆者認為在對比劑腎病中，各細胞間的通訊也可能通過外泌體實現。

外泌體的提取與鑒定是本研究的首要環(huán)節(jié)。本研究采用商品化試劑盒通過沉淀法從巨噬細胞培養(yǎng)上清液中分離得到外泌體，與傳統的超速離心法相比較，具有分離快、產量大、純度高的優(yōu)點，是較為常用的分離方法［15］。外泌體上富含多種跨膜轉運蛋白、多囊泡胞內體產生相關蛋白等，與外泌體的產生與功能有關，可作為外泌體鑒定的特征性標志物。本研究采用Western blot 檢測CD63 和TSG101 的表達，結果顯示在分離的外泌體中兩者均呈高表達，而未檢測到內質網蛋白calnexin表達，提示其不含其他細胞成分，純度較高，與文獻［14］報道結果一致。外泌體主要由內吞的方式被攝取，本研究也通過熒光標記的方法證實巨噬細胞來源的外泌體可被HK-2細胞攝取，且主要分布于核膜附近，即胞漿中。但是，本研究未對外泌體攝取的具體通路進行深入探討，據陳曦等［16］分析可能與網格蛋白介導的內吞通路或膽固醇等非網格蛋白依賴的內吞途徑有關，這有待今后進一步研究。

為了進一步探討巨噬細胞來源的外泌體可否介導腎小管上皮細胞損傷，本研究使用分離得到的外泌體刺激腎小管上皮細胞，結果顯示與Con組、NCExo組比較，CIN-Exo組細胞的凋亡率以及凋亡促進蛋白Bax、Cleaved caspase-3 表達量均升高，凋亡抑制蛋白Bcl-2 表達量降低，提示巨噬細胞在碘海醇刺激后分泌的外泌體可誘導腎小管上皮細胞凋亡。郭銀鳳等［17］報道，高糖環(huán)境活化的巨噬細胞上清液可促進足細胞凋亡，與本研究結果一致，并進一步指出外泌體成分在細胞上清液中的關鍵作用。此外，郭銀鳳等［17］認為，上清液中含有的高濃度炎性因子是誘導細胞凋亡的效應分子。本研究結果顯示，CIN-Exo 組細胞中IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA 水平高于Con組和NC-Exo組，證實了炎性因子在外泌體促凋亡效應中的作用。值得注意的是，與Con 組比較，NC-Exo組細胞的凋亡率及炎性因子表達水平也有所上調，提示巨噬細胞在不經碘海醇誘導的情況下，依然可以對腎小管上皮細胞造成一定損傷。

HMGB1 是真核細胞內普遍存在的非組蛋白染色體蛋白，在胞核內主要發(fā)揮穩(wěn)定核小體、調節(jié)基因轉錄的作用，但是在各種因素刺激下可分泌至細胞外，與細胞表面受體TLR4結合，誘導炎癥反應［18-19］。為了進一步探究外泌體中發(fā)揮損傷效應的活性成分，本研究對這種可介導炎癥級聯反應的關鍵分子HMGB1 進行檢測，結果顯示HMGB1 在碘海醇誘導的巨噬細胞外泌體中表達顯著升高，提示外泌體HMGB1 可能是發(fā)揮損傷效應的關鍵分子。甘草酸苷可與HMGB1直接結合，從而發(fā)揮特異性抑制劑的作用［20-21］。本研究結果顯示，甘草酸苷可顯著抑制碘海醇對外泌體HMGB1的上調效應，進一步降低腎小管上皮細胞的凋亡率與炎性因子表達水平，下調HMGB1/TLR4/NF-κB 信號通路相關蛋白的表達，從而發(fā)揮保護效應。

綜上所述，本研究揭示了巨噬細胞來源外泌體及其HMGB1 高表達在對比劑誘導腎小管上皮細胞凋亡和炎癥反應中的關鍵作用，為對比劑腎病發(fā)病機制的研究提供了一個新的視角。甘草酸苷作為傳統中藥材甘草的主要活性成分，本研究為其用于對比劑腎病的治療提供了一定的理論依據。