劉朝暉，馬劍雄，田愛(ài)現(xiàn)，孫曉雷，張楊，郭悅，馬信龍△

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是一種以骨量降低與骨微結(jié)構(gòu)退化為特征的運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)疾病，骨折是其最常見(jiàn)的并發(fā)癥［1］。預(yù)計(jì)到2050年，我國(guó)骨質(zhì)疏松癥患者將增至599萬(wàn)例，相關(guān)治療費(fèi)用將高達(dá)254.3億美元［2］。因此，OP的防治具有重要的社會(huì)意義。

破骨細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，由單核細(xì)胞融合分化而成，是唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，其分泌的組織蛋白酶K（CK）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）是破骨細(xì)胞降解骨基質(zhì)的重要蛋白水解酶［3］。破骨細(xì)胞具有獨(dú)特的細(xì)胞器分布和質(zhì)膜結(jié)構(gòu)域，與骨組織接觸的細(xì)胞膜區(qū)域通過(guò)特殊的黏附結(jié)構(gòu)形成封閉區(qū)，其間的細(xì)胞膜具有微絨毛結(jié)構(gòu)樣褶皺緣，兩者形成相對(duì)獨(dú)立的骨吸收間隙，完成細(xì)胞極化［4］。整合素（integrin）是細(xì)胞表面受體超家族蛋白，調(diào)節(jié)黏附、遷移及封閉區(qū)的形成，對(duì)破骨細(xì)胞分化和激活具有重要意義［5-6］。非受體酪氨酸激酶（c-src）是一種原癌基因，c-src及其磷酸化產(chǎn)物p-src調(diào)節(jié)細(xì)胞極化、遷移及褶皺緣的形成，敲除c-src的小鼠體內(nèi)破骨細(xì)胞無(wú)法形成正常偽足，導(dǎo)致小鼠患骨硬化癥［7-8］。

骨碎補(bǔ)是治療OP的主要中藥之一，具有不良反應(yīng)小，療效明顯等優(yōu)點(diǎn)，其主要有效成分是雙氫黃酮類單體柚皮苷。有關(guān)柚皮苷抗OP 的分子機(jī)制的研究多集中于相關(guān)信號(hào)通路方面［9-11］，然而關(guān)于柚皮苷和破骨細(xì)胞分化極化關(guān)系的研究并未見(jiàn)報(bào)道。本文旨在探究柚皮苷能否通過(guò)影響破骨細(xì)胞分化與極化進(jìn)而影響破骨細(xì)胞的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料 柚皮苷購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，小鼠單核細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽公司，高糖DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，重組小鼠可溶性核因子κB 受體活因子配體（sRANKL）、兔integrin β3 一抗購(gòu)自美國(guó)Peprotech 公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司，小鼠MMP-9 一抗購(gòu)自美國(guó)R&D Systems公司，兔CK一抗、羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，兔p-src 一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）引物購(gòu)自武漢塞維爾公司，qPCR試劑盒購(gòu)自北京Takara公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠RAW264.7 細(xì)胞系培養(yǎng)于含10% FBS的DMEM 培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔1 d換液1次，細(xì)胞密度約為80%時(shí)傳代至6孔板。配置含10%FBS，100 μg/L sRANKL。對(duì)照組加入0 μg/L 柚皮苷培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)組分別加入2、20 和200 μg/L 柚皮苷培養(yǎng)液，每組3 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，隔日換液，連續(xù)培養(yǎng)7 d。

1.3 TRAP 染色 細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后，棄掉培養(yǎng)液，PBS 沖洗3次，4%多聚甲醛固定60 s，PBS沖洗，使用TRAP染液于37 ℃下避光孵育1 h，PBS 沖洗后使用蘇木素復(fù)染30 s。4 組細(xì)胞均在100 倍視野下，隨機(jī)讀取10 個(gè)視野進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)（陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核≥3個(gè)且胞質(zhì)呈酒紅色）。

1.4 qPCR 檢測(cè)CK、MMP-9、integrin β3及c-srcmRNA 相對(duì)表達(dá)量 不同劑量柚皮苷干預(yù)細(xì)胞7 d，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，依次使用Trizol、氯仿、乙醇及DEPC 水等抽提總RNA，操作均在冰上進(jìn)行，根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA 的逆轉(zhuǎn)錄及cDNA 的擴(kuò)增。逆轉(zhuǎn)錄條件：42 ℃15 min，85 ℃5 s。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法。引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1 Amplification of gene primers by fluorescence quantitative PCR表1 qPCR擴(kuò)增基因引物序列

1.5 蛋 白 免 疫 印跡（Western blot）法檢測(cè)CK、MMP-9、integrin β3 及p-src 蛋白相對(duì)表達(dá)量 不同劑量柚皮苷干預(yù)細(xì)胞7 d，待細(xì)胞融合至90%時(shí)，在孔板中加入含PMSF 的高效組織裂解液RIPA，冰上反復(fù)吹打，12 000×g離心10 min 后取上清。加入上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min 使蛋白變性，10%SDS-PAGE 分離蛋白后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉抗原1 h 后，稀釋一抗CK（1∶1 000）、MMP-9（1∶800）、integrin β3（1∶1 000）及p-src（1∶1 000），4 ℃孵育過(guò)夜，隔天TBST洗膜3次，稀釋二抗，羊抗鼠二抗（1∶20 000）、羊抗兔二抗（1∶20 000），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液顯影曝光。分析各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Dunnet-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的影響 對(duì)照組、2 μg/L 組、20 μg/L 組和200 μg/L 組陽(yáng)性破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)（個(gè)/100 倍視野）分別為29.50±2.22、23.20±1.81、20.10±0.88和16.20±1.03。與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組TRAP 染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均顯著降低（n=10，F(xiàn)=104.612，P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Fig.1 Effects of naringin on TRAP staining(left×100,right×200)圖1 柚皮苷對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果的影響（左×100，右×200）

2.2 柚皮苷對(duì)CK、MMP-9、integrin β3、c-srcmRNA表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，20 μg/L和200 μg/L 組CK、MMP-9、integrin β3mRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組c-srcmRNA 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

Tab.2 Effects of naringin on mRNA expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and c-src表2 各組CK、MMP-9、integrin β3及c-src mRNA表達(dá)水平的比較（n=3，±s）

Tab.2 Effects of naringin on mRNA expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and c-src表2 各組CK、MMP-9、integrin β3及c-src mRNA表達(dá)水平的比較（n=3，±s）

＊P＜0.05，a與對(duì)照組比較，b與2 μg/L組比較，c與20 μg/L組比較，P＜0.05；表3同

組別對(duì)照組2 μg/L組20 μg/L組200 μg/L組F CK 1.00±0.00 0.77±0.21 0.67±0.01a 0.44±0.10ab 11.607＊MMP-9 1.00±0.00 0.75±0.16 0.67±0.19a 0.60±0.18a 8.725＊intergrin β3 1.00±0.00 0.73±0.15 0.68±0.16a 0.49±0.08a 9.857＊c-src 1.00±0.00 0.75±0.06a 0.68±0.09a 0.39±0.09abc 37.453＊

2.3 柚皮苷對(duì)CK、MMP-9、integrin β3、p-src蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，20 μg/L組和200 μg/L 組CK 和p-src 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），各實(shí)驗(yàn)組MMP-9和integrin β3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表3。

Fig.2 Effects of naringin on protein expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and p-src圖2 各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

Tab.3 Effects of naringin on protein expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and p-src表3 各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較（n=3，±s）

Tab.3 Effects of naringin on protein expressions of CK,MMP-9,integrin β3 and p-src表3 各組CK、MMP-9、integrin β3及p-src蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較（n=3，±s）

組別對(duì)照組2 μg/L組20 μg/L組200 μg/L組F CK 1.00±0.00 0.86±0.10 0.59±0.06ab 0.55±0.10ab 21.467＊MMP-9 1.00±0.00 0.73±0.06a 0.56±0.04ab 0.50±0.05ab 72.850＊integrin β3 1.00±0.00 0.53±0.04a 0.51±0.06a 0.49±0.04a 121.361＊p-src 1.00±0.00 0.83±0.14 0.49±0.14ab 0.36±0.08ab 22.341＊

3 討論

骨是一種礦化的結(jié)締組織，破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)于骨重塑和骨微環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義［12］。破骨細(xì)胞通過(guò)空泡腺苷三磷酸（ATP）酶、補(bǔ)體3a、軸突導(dǎo)向因子4D及微小RNA等影響成骨細(xì)胞骨形成；成骨細(xì)胞通過(guò)骨保護(hù)素/核因子受體活化因子/核因子受體活化因子配體（OPG/RANK/RANKL）、核因子受體活化因子配體/G 蛋白偶聯(lián)受體4/核因子受體活化因子（RANKL/LGR4/RANK）、促紅細(xì)胞生成肝細(xì)胞激酶受體相互作用蛋白B2/促紅細(xì)胞生成肝細(xì)胞激酶B4（EphrinB2/ephB4）和死亡受體/死亡配體（Fas/Fasl）等通路影響破骨細(xì)胞分化與凋亡［13］。破骨細(xì)胞特有的超微結(jié)構(gòu)是完成其骨吸收功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過(guò)重組細(xì)胞骨架形成極化構(gòu)象，將細(xì)胞表面膜分為4個(gè)區(qū)域，即封閉區(qū)、褶皺緣、基底外側(cè)區(qū)和功能分泌區(qū)［14］。極化的破骨細(xì)胞通過(guò)足質(zhì)體黏附于骨表面，肌動(dòng)蛋白環(huán)圍繞褶皺緣形成相對(duì)獨(dú)立的微環(huán)境，通過(guò)釋放CK 和MMP-9 等水解酶實(shí)現(xiàn)骨吸收［15-16］。

柚皮苷又稱柚柑、異橙皮苷，是中藥骨碎補(bǔ)的重要成分。其化學(xué)本質(zhì)是一種雙氫黃酮類單體，分子式為C27H32O14，部分空間結(jié)構(gòu)與雌激素類似，具有抗炎、抗氧化及改善微循環(huán)等功效。本研究中TRAP染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著降低，提示柚皮苷對(duì)破骨細(xì)胞的分化具有一定的抑制作用。qPCR 與Western blot 結(jié)果提示柚皮苷可以抑制CK與MMP-9 在破骨細(xì)胞中的表達(dá)。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)多種組織蛋白酶與破骨細(xì)胞功能相關(guān)，包括組織蛋白酶BE及組織蛋白酶G等，但是CK是骨吸收區(qū)酸性環(huán)境下發(fā)揮骨吸收作用的主要蛋白酶。同時(shí)，臨床研究發(fā)現(xiàn)CK抑制劑可以有效降低骨吸收指標(biāo)，提高患者骨密度［3］。MMP-9 是一種鋅依賴蛋白水解酶，在哺乳動(dòng)物胚胎期軟骨內(nèi)成骨及骨重建過(guò)程中起到膠原酶的作用，在細(xì)胞外基質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用，是破骨細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞侵入礦化組織所必須的生物因子，破骨細(xì)胞分化過(guò)程中，MMP-9表達(dá)上調(diào)，加速骨吸收［17］。Kim 等［18］在斑馬魚(yú)骨質(zhì)疏松模型中發(fā)現(xiàn)，抑制MMP-9可以增加鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色程度及椎體骨密度，改善骨質(zhì)疏松程度。

目前許多研究證明柚皮苷可以抑制破骨細(xì)胞功能。Ang 等［19］發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以抑制RANKL 介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB和細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）信號(hào)通路，干擾破骨細(xì)胞的形成和功能。Li 等［20］證實(shí)柚皮苷通過(guò)下調(diào)抗凋亡蛋白B 淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2），上調(diào)促凋亡蛋白Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）及細(xì)胞色素C促進(jìn)破骨細(xì)胞凋亡。Yu等［21］通過(guò)對(duì)骨吸收陷窩面積定量分析，發(fā)現(xiàn)柚皮苷對(duì)骨吸收有明顯抑制作用。目前研究大多聚焦于柚皮苷對(duì)信號(hào)通路的影響，然而破骨細(xì)胞的極化是其發(fā)揮骨吸收功能的重要生理過(guò)程。本研究重點(diǎn)探討柚皮苷對(duì)破骨細(xì)胞黏附與極化功能影響，發(fā)現(xiàn)2 μg/L 組和20 μg/L 組integrin β3與src的表達(dá)降低，提示柚皮苷可以抑制破骨細(xì)胞黏附和極化。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，integrin β3 和src 在破骨細(xì)胞黏附和極化過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，integrin與含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的蛋白（RGD）結(jié)合是破骨細(xì)胞極化的先決條件［22］。Mo等［23］在研究牙齦炎時(shí)發(fā)現(xiàn)，牙齦炎導(dǎo)致integrin β3表達(dá)上升，增強(qiáng)破骨細(xì)胞骨吸收功能，使用integrin β3特異性拮抗劑西侖吉肽后，破骨細(xì)胞功能受到抑制?；诘鞍仔酒夹g(shù)研制的新型蛋白質(zhì)抑制劑IPS-02001 可以抑制integrin 與骨橋蛋白結(jié)合，其抗骨質(zhì)疏松作用已經(jīng)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證，目前美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）尚未批準(zhǔn)integrin 拮抗劑類藥物上市，但臨床前評(píng)估已經(jīng)取得了令人滿意的結(jié)果［24］。1991年Soriano等［25］首次發(fā)現(xiàn)c-src缺失會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞功能不全。c-src 與integrin 在骨吸收過(guò)程中是相互偶聯(lián)的。integrin αvβ3是integrin的一種異二聚體，脾酪氨酸激酶（Syk）是一種調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能的酪氨酸激酶，位于免疫調(diào)節(jié)蛋白Dap12 和 免 疫 球 蛋 白FcRγ 下 游，細(xì) 胞 內(nèi)c-src、integrin αvβ3及Syk形成三元復(fù)合物，通過(guò)自身磷酸化激活鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子（Vas3），將小G 蛋白超家族（Rho）蛋白轉(zhuǎn)化成結(jié)合鳥(niǎo)苷三磷酸（GTP）的激活態(tài)，在肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3（Arp2/3）復(fù)合體作用下形成肌動(dòng)蛋白環(huán)，在突觸結(jié)合蛋白Ⅶ協(xié)同下，肌動(dòng)蛋白環(huán)收縮形成褶皺緣，完成細(xì)胞極化［15，26-27］。本研究初步發(fā)現(xiàn)柚皮苷可以在一定程度上抑制破骨細(xì)胞分化，降低CK、MMP-9、integrin β3、c-src 及psrc的表達(dá)，提示抑制破骨細(xì)胞分化與極化可能是柚皮苷抗OP 的機(jī)制之一。本研究的不足之處是僅觀察了基因與蛋白水平的變化，尚未進(jìn)行上游信號(hào)通路方面的深入研究。另外，本研究目的重點(diǎn)是分析干預(yù)的有效性，實(shí)驗(yàn)分組尚未篩選出抑制效果最顯著的藥物劑量，有待于后續(xù)研究進(jìn)一步探討。