王春冉 胡石奇 羅祖洋

結(jié)腸癌是世界范圍內(nèi)第三大常見惡性腫瘤，其在50歲以上人群中的發(fā)病率超過20%，死亡率在10%以上[1-2]。隨著靶向藥物制劑的發(fā)展，對結(jié)腸癌早期診斷的分子生物學(xué)靶點(diǎn)的研究是治療中晚期結(jié)腸癌的重要方向。MicroRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性表達(dá)的非編碼RNA，由18～22個(gè)核苷酸組成，可以對靶基因3'-UTR端進(jìn)行特異性識別，從而對下游靶基因進(jìn)行降解或者阻斷靶基因的翻譯，在惡性腫瘤的發(fā)展中具有重要作用[3-4]。miR-154已被證實(shí)在非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌等多種腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮調(diào)控作用[5-6]，但其在結(jié)腸癌中的作用尚未見報(bào)道。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，從而具備間質(zhì)細(xì)胞的游走遷移和浸潤能力，細(xì)胞形態(tài)與生物學(xué)特性均向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。上皮源性的腫瘤細(xì)胞可通過EMT過程獲得相應(yīng)的遷移與侵襲能力，這在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用[7-8]。

本研究檢測了miR-154在結(jié)腸癌發(fā)展過程中的表達(dá)情況，并對其可能存在的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2018年7月至2019年5月于廣州市第一人民醫(yī)院結(jié)直腸肛門外科進(jìn)行結(jié)腸癌手術(shù)的患者60例，術(shù)中取切除的新鮮結(jié)腸癌組織標(biāo)本和距癌組織5 cm以上距離的手術(shù)遠(yuǎn)端切緣的癌旁組織，所有患者均經(jīng)組織病理學(xué)確診為結(jié)腸癌并首次進(jìn)行切除手術(shù)，術(shù)前未經(jīng)放療、化療等輔助治療。納入研究的患者基線資料：平均年齡(60.1±8.3)歲，其中60歲以上患者24例(40.0%)，60歲以下患者36例(60.0%)；男性患者35例(58.3%)，女性患者25例(41.7%)；按照國際抗癌聯(lián)盟(Union for International Cancer Control，UICC)與美國癌癥聯(lián)合會(huì)(American Joint Committee on Cancer，AJCC)2017年聯(lián)合發(fā)布的第八版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ、Ⅱ期：36例(60.0%)，Ⅲ、Ⅳ期：24例(40.0%)；組織分化程度：高中分化32例(53.3%)，低分化28例(46.7%)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例(48.3%)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例(51.7%)。

1.2 細(xì)胞、試劑與儀器

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；miR-154 inhibitor、miR-154NC及miR-154引物序列由廣州銳博生物公司合成，含雙抗的1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000、Trizol、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Sigma公司；兔抗人BMI1、β-catenin、Vimentin一抗購自美國Invitrogen公司，鼠抗人β-actin購自碧云天生物技術(shù)有限公司；雙人水平超凈工作臺(tái)(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；二氧化碳細(xì)胞孵育箱(美國Thermo公司)；低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；S1000型PCR擴(kuò)增儀(美國BIO-RAD公司)；電轉(zhuǎn)儀系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；DYC-p32型電泳儀(上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)；轉(zhuǎn)膜儀(南京生興生物經(jīng)濟(jì)技術(shù)有限公司)；圖像記錄分析系統(tǒng)：大連Jim-X Scientific。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇與轉(zhuǎn)染

將凍存的SW480細(xì)胞解凍、復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清和1%雙抗的1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2環(huán)境的恒溫培養(yǎng)箱中，待其貼壁。取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105個(gè)/ml，接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，按照說明書要求，用Lipofectamine2000將miR-154抑制物(miR-154 inhibitor)和陰性對照(miR-154 normal control，miR-154 NC)轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，Opti-MEM 培養(yǎng)液替換常規(guī)培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染8 h后換為常規(guī)培養(yǎng)液。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞以約5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板，于不含F(xiàn)BS的RPMI-1640培養(yǎng)液中饑餓處理12 h；用10 μl的移液槍頭垂直于板面劃痕，之后每4 h觀察一次細(xì)胞遷移狀態(tài)，于倒置熒光顯微鏡下拍照，用做圖軟件處理，計(jì)算每組細(xì)胞24時(shí)和0時(shí)的劃痕寬度之比。

1.5 RT-PCR檢測miR-154表達(dá)

取凍存的癌組織和癌旁組織于液氮預(yù)冷的研缽中研磨成粉末，加1 ml Trizol，按說明書中所示步驟提取總RNA，行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2 μl RNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增：內(nèi)參β-actin引物序列：F:5'-TAGCTAGGGCTTAGCTTGGC-3'，R:5'-TGGGCTAGGGCAAACTGACA-3'，miR-154引物序列：F:5'-CTGGATCGATTCGGCTAAAC-3'，R:5'-TAGGCTAGGCTTAGCTAACG-3'，擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸6 min。取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外線投射儀下觀察電泳條帶，Image Pro Plus 6.0分析目的基因和參比基因的條帶灰度值比值。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，取離心并洗滌后的細(xì)胞，Trizol提取總RNA，后續(xù)步驟同上，檢測miR-154基因表達(dá)。

1.6 Western Blot檢測組織、細(xì)胞內(nèi)BMI1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)

取凍存的癌組織和癌旁組織，RIPA裂解液提取總蛋白，將蛋白樣品加入SDS-PAGE凝膠加樣孔進(jìn)行電泳，使蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉2 h，TBST溫和洗膜3 min后加入相對應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗滌10 min×3次，加入二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗滌10 min×3次，加入配制好的ECL發(fā)光液，避光孵育5 min，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀中采集圖片信息，圖片用Image pro plus 6.0軟件進(jìn)行灰度分析。每個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果獨(dú)立重復(fù)3次。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中將各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，取離心并洗滌后的細(xì)胞，后續(xù)步驟同上，檢測BMI1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 癌組織、癌旁組織內(nèi)miR-154和BMI1的表達(dá)

miR-154在癌組織的表達(dá)顯著低于癌旁組織(t=13.22,P<0.001)，而BMI1在癌組織的表達(dá)顯著高于癌旁組織(t=10.313,P<0.001)，見圖1。

注：A為miR154表達(dá)的RT-PCR電泳圖；B為BMI1蛋白表達(dá)Western Blot電泳圖；C為miR154表達(dá)的RT-PCR結(jié)果分析；D為BMI1蛋白表達(dá)Western Blot結(jié)果分析。*為與癌旁組織相比，P<0.05。

2.2 miR-154和BMI1在癌組織中的表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性

miR-154、BMI1表達(dá)與結(jié)腸癌患者的性別、年齡無關(guān)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、分化程度有關(guān)，見表1。

表1 miR-154和BMI1表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理的相關(guān)性

2.3 轉(zhuǎn)染miR-154 inhibitor和miR-154 NC的SW480細(xì)胞遷移能力的比較

轉(zhuǎn)染24 h后，miR-154 NC組細(xì)胞劃痕間寬度與0 h時(shí)寬度之比為(0.21±0.03)；miR-154 inhibitor組細(xì)胞劃痕間寬度與0 h時(shí)寬度之比為(0.79±0.08)，顯著高于miR-154 NC組(t=12.45,P<0.001)。見圖2。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染miR-154 inhibitor和miR-154 NC的SW480細(xì)胞遷移能力

2.4 轉(zhuǎn)染miR-154 inhibitor和miR-154 NC的SW480細(xì)胞內(nèi)BMI1、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)比較

轉(zhuǎn)染miR-154 inhibitor的SW480細(xì)胞內(nèi)BMI1和E-cadherin的表達(dá)顯著高于轉(zhuǎn)染miR-154 NC的細(xì)胞(tBMI1=11.311,P<0.001;tE-cadherin=15.341，P<0.001)，而Vimentin的表達(dá)顯著低于轉(zhuǎn)染miR-154 NC的細(xì)胞(t=9.203,P<0.001)。見圖3。

3 討論

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，靶向藥物的發(fā)展是改善中晚期結(jié)腸癌患者預(yù)后的重要方向。miRNA具有表達(dá)穩(wěn)定的性質(zhì)，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要調(diào)控作用，在惡性腫瘤的診斷、靶向治療中有重要的應(yīng)用價(jià)值。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在惡性腫瘤的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是腫瘤細(xì)胞獲得遷移能力的重要途徑[7-8]。miR-154已被證實(shí)在多種惡性腫瘤細(xì)胞的EMT過程中發(fā)揮調(diào)控作用。Lin等研究證實(shí)[5]，miR-154能靶向ZEB2而抑制非小細(xì)胞肺癌的遷移和侵襲；Chen等報(bào)道[6]miR-154靶向HMGA2抑制前列腺癌細(xì)胞的EMT。同時(shí)有研究證實(shí)[9]，miR-154通過靶向抑制BMI1的表達(dá)而抑制非小細(xì)胞肺癌的EMT。以上研究說明，miR-154通常作為抑癌基因在多種腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮作用，但其在結(jié)腸癌中發(fā)揮的作用尚未見報(bào)道。本研究中，我們首先檢測了miR-154在結(jié)腸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-154在癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁組織，同時(shí)，miR-154在存在轉(zhuǎn)移、分化程度較低及TNM分期較高的癌組織中都呈現(xiàn)低表達(dá)，以上研究結(jié)果提示，miR-154在結(jié)腸癌中可能也是作為抑癌基因發(fā)揮作用。為了驗(yàn)證miR-154對結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程是否有影響，我們用載有miR-154-inhibitor和miR-154-NC的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞，并檢測24 h內(nèi)細(xì)胞的遷移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-154-inhibitor組細(xì)胞的遷移能力顯著高于miR-154 NC組，說明抑制了miR-154表達(dá)后，結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力隨之提升，提示miR-154對結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程可能有抑制作用。

注：*為與miR-154 inhibitor組相比，P<0.05。

BMI1是多梳基因抑制復(fù)合體1(PRC1)家族成員，多項(xiàng)研究證實(shí)，BMI1在結(jié)腸癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，發(fā)揮促癌作用[10-11]。上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)是EMT發(fā)生過程中2個(gè)標(biāo)志性因子，其中E-cadherin是上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，而Vimentin是間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物[12]。有研究證實(shí)[13-14]，BMI1能抑制E-cadherin的表達(dá)，刺激Vimentin的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT。本研究中，我們檢測了BMI1在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示BMI1在癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，這一發(fā)現(xiàn)與既往報(bào)道相一致[10-11]。有報(bào)道稱miR-154在肺癌細(xì)胞中對BMI1有靶向調(diào)控作用[9]，基于這一理論，我們檢測了miR-154在結(jié)腸癌細(xì)胞中能否通過BMI1發(fā)揮作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-154-inhibitor組SW480細(xì)胞中BMI1的表達(dá)顯著高于miR-154 NC組，與此同時(shí)，miR-154-inhibitor組細(xì)胞E-cadherin顯著高于miR-154 NC組，Vimentin顯著低于miR-154 NC組，說明抑制了miR-154的表達(dá)后，BMI1的表達(dá)被上調(diào)，繼而刺激E-cadherin的表達(dá)，抑制Vimentin的表達(dá)，同時(shí)，與miR-154表達(dá)規(guī)律相反，BMI1在存在轉(zhuǎn)移、分化程度較低及TNM分期較高的癌組織中都呈現(xiàn)高表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在結(jié)腸癌細(xì)胞中，BMI1可能是miR-154的靶基因，其低表達(dá)繼而調(diào)控EMT相關(guān)因子的表達(dá)。

綜上所述，miR-154在結(jié)腸癌中可能作為抑癌基因發(fā)揮作用，其機(jī)制可能是通過抑制BMI1基因表達(dá)，從而調(diào)控EMT相關(guān)因子水平，最終抑制了腫瘤細(xì)胞的EMT過程。