朱廣偉 王 丹 高虎方 張新潮

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是以惡性漿細(xì)胞聚集血液、骨髓、尿液中出現(xiàn)單克隆蛋白為特征的1種惡性疾病，約占所有血液惡性腫瘤的10%[1]。該病在臨床上主要表現(xiàn)為溶骨性病變、感染、腎功能受損、貧血等，多發(fā)病于老年人[2]。微小RNA(miRNAs)是一類長(zhǎng)度約21～25 nt的非編碼單鏈RNA分子，其能夠與相應(yīng)的mRNA的3’-非編碼區(qū)結(jié)合，使其降解或抑制其翻譯，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、分化、增殖等代謝過(guò)程[3-4]。miRNAs的表達(dá)變化可以用來(lái)監(jiān)測(cè)多發(fā)性骨髓瘤的進(jìn)展，也可以作為良好的多發(fā)性骨髓瘤診斷標(biāo)記物[5]。當(dāng)前研究表明miRNA-21與腫瘤發(fā)生、耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，miRNA-21可抑多個(gè)腫瘤抑制基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤轉(zhuǎn)移與侵襲等作用[6]。研究發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤患者的外周血miRNA-21 比正常漿細(xì)胞高15倍左右[7]，但多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中miRNA-21表達(dá)情況及其意義還不明確。本文具體探討了miRNA-21在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，希望明確miRNA-21的檢測(cè)意義?，F(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

2014年3月到2019年10月選擇在本院診治的多發(fā)性骨髓瘤患者62例作為MM組，診斷標(biāo)準(zhǔn)均依據(jù)世界衛(wèi)生組織推薦的MM診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理確診為多發(fā)性骨髓瘤；年齡30～70歲；首次發(fā)??；醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此次研究；患者簽署了知情同意書；臨床與病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：取樣前經(jīng)內(nèi)分泌、放療等治療；嚴(yán)重心、肝、腎功能異常；臨床與病理資料缺乏者。其中男性34例，女性28例；年齡32～68歲，平均年齡(58.22±3.19)歲；平均病程(4.11±0.12)年；平均體重指數(shù)(22.47±1.27)kg/m2；臨床分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期20例，Ⅲ期10例；細(xì)胞學(xué)分型：成熟漿細(xì)胞型22例，幼漿細(xì)胞型16例，原漿細(xì)胞型10例，網(wǎng)狀細(xì)胞型14例。

同期選擇在本院進(jìn)行骨髓捐獻(xiàn)的健康人員62例作為對(duì)照組，其中男性32例，女性30例；年齡31～69歲，平均年齡(59.02±3.18)歲；平均體重指數(shù)(23.01±2.18)kg/m2。兩組性別、體重指數(shù)、年齡等對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 骨髓miRNA-21檢測(cè)

取所有入選者的骨髓樣本1 ml左右，本均置于生化紅色真空采樣管中，取1 500 rpm/min離心10 min，取上層組織。提取總RNA(試劑盒購(gòu)自QIAGEN公司)，取1 μl RNA 用Nano核酸紫外分析儀檢測(cè)總RNA純度與濃度。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用qPCR方法檢測(cè)miRNA-21表達(dá)水平，正向引物序列：5'-GCGGCGAACATTCAACGATG-3'，反向引物序列:5'-GTGCAGGGTCCGAGG-3'，PCR條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃ 12 s、58 ℃40 s(40個(gè)循環(huán))，讀取熒光信號(hào)，計(jì)算2-ΔΔCt，即為miRNA-21的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)與記錄兩組入選者的血清β2-MG、IgG、IgA水平，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)乳酸脫氫酶(LDH)、白蛋白(ALB)、血紅蛋白(Hb)含量。所有患者隨訪至今(2020年3月1日)，記錄預(yù)后與生存情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

在統(tǒng)計(jì)分析時(shí)應(yīng)用的軟件是SPSS 22.0，計(jì)量數(shù)據(jù)采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析，多因素預(yù)測(cè)采用COX模型回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α<0.05。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-21相對(duì)表達(dá)水平對(duì)比

MM組的miRNA-21相對(duì)表達(dá)量(7.78±0.43)，顯著高于對(duì)照組(1.10±0.11)(P<0.05，t=22.483)。

2.2 血液學(xué)指標(biāo)對(duì)比

MM組的血清IgG、IgA、β2-MG值高于對(duì)照組，ALB、LDH與Hb值低于對(duì)照組，對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組血液學(xué)指標(biāo)對(duì)比

2.3 預(yù)后情況

MM組患者隨訪至今(2020年2月1日)，平均隨訪時(shí)間(32.72±2.28)個(gè)月，死亡18例(均因MM死亡)，死亡率為29.0%。患者生存時(shí)間見圖1。

2.4 相關(guān)性分析

直線相關(guān)分析顯示：多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后死亡與miRNA-21、β2-MG、IgA、臨床分期呈正相關(guān)性(P<0.05)，與ALB、LDH、Hb呈負(fù)相關(guān)性(P<0.05),見表2。

圖1 MM組患者的累積生存函數(shù)圖

2.5 危險(xiǎn)因素分析

在62例MM組患者中，以患者隨訪預(yù)后死亡作為因變量，COX回歸分析顯示：miRNA-21、臨床分期、β2-MG、Hb、ALB為影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后死亡的主要因素(HR>1，P<0.05)，見表3。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤是1種漿細(xì)胞的惡性腫瘤，好發(fā)于老年人[8]。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，雖然部分藥物可控制患者的病情，但是很多患者容易復(fù)發(fā)，死亡率一直居高不下[9]。本研究顯示MM組的血清IgG、IgA、β2-MG值高于對(duì)照組，ALB、LDH與Hb值低于對(duì)照組，對(duì)比差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。當(dāng)前多發(fā)性骨髓瘤主要靠臨床癥狀結(jié)合一些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)如血清Hb、β2-MG、ALB等進(jìn)行診斷監(jiān)測(cè)，臨床診斷的敏感性一直比較低，因此有必要探索新的多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)生物標(biāo)志物[10]。特別是多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病是1個(gè)逐步發(fā)展的過(guò)程，部分患者可由單克隆免疫球蛋白病可直接發(fā)展成該病，導(dǎo)致常規(guī)血液學(xué)指標(biāo)檢測(cè)也存在一定的誤差[11]。

miRNA是1種小分子非編碼RNA，具有保守內(nèi)源性，miRNA調(diào)控人類基因組中1/3的編碼基因，參與體內(nèi)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等，其中約40個(gè)miRNAs被研究報(bào)道與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生與發(fā)展有一定的相關(guān)性[12]。外周血中的循環(huán)miRNA分子表達(dá)能反映相應(yīng)組織器官的病理變化，在腫瘤中，旺盛新陳代謝可使得大量miRNA 分子進(jìn)入血液循環(huán)，但是在骨髓中的表達(dá)還無(wú)相關(guān)報(bào)道。miRNA-21是研究比較多的miRNA 分子，在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)異常，可作為區(qū)分惡性腫瘤與良性腫瘤的生物標(biāo)志物[13]。本研究顯示MM組的miRNA-21相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。從機(jī)制上分析，miRNA-21的成熟前體Pre-miRNA-21定位于染色體17p12，在多發(fā)性骨髓瘤中17p12位點(diǎn)可表現(xiàn)為激活狀態(tài)，從而發(fā)揮促癌作用。當(dāng)前也有研究顯示miRNA-21與腫瘤進(jìn)展關(guān)系密切，骨髓瘤細(xì)胞miRNA-21表達(dá)顯著高于正常對(duì)照漿細(xì)胞的表達(dá)水平，對(duì)骨髓瘤的預(yù)后有預(yù)測(cè)價(jià)值[14]。

當(dāng)前對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤的診斷與預(yù)后預(yù)測(cè)主要依賴于影像學(xué)檢查、骨髓活檢、常規(guī)生化指標(biāo)檢查與血清β2-MG檢測(cè)，但是都存在一定的不足與缺陷。miRNA分子具有良好的穩(wěn)定性、組織特異性和顯著的腫瘤相關(guān)性，還具有技術(shù)快速、獲取簡(jiǎn)便、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)。miRNA-21為1種促癌因子，其可能的靶基因包括程序性細(xì)胞死亡因子4、磷酸酯酶-張力蛋白同源物、原肌球蛋白，抑制miRNA-21的表達(dá)可以增加化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的抑制作用[15]。還有研究顯示miRNA-21高表達(dá)能顯著上調(diào)細(xì)胞周期的Cyclin D表達(dá)，激活PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)G1期向S期轉(zhuǎn)換，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞異常增殖[16-17]。本研究顯示MM組患者隨訪至今(2020年3月1日)，平均隨訪時(shí)間(32.72±2.28)個(gè)月，死亡18例，死亡率為29.0%；直線相關(guān)分析顯示多發(fā)性骨髓瘤患者的預(yù)后死亡與miRNA-21、β2-MG、IgA、臨床分期成正相關(guān)性(P<0.05)，與ALB、LDH、Hb成負(fù)相關(guān)性(P<0.05)。表明miRNA-21可參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的變化，從而影響患者的預(yù)后。

多發(fā)性骨髓瘤患者中位生存時(shí)間約為3年，多數(shù)患者對(duì)化療藥物還是比較敏感，但是也有部分患者可出現(xiàn)耐藥和臨床復(fù)發(fā)[18-19]。探究多發(fā)性骨髓瘤的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)，對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。本研究顯示COX回歸分析顯示miRNA-21、臨床分期、β2-MG、Hb、ALB等影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后死亡的主要因素(P<0.05)。從機(jī)制上分析，miRNA-21對(duì)編碼基因的表達(dá)具有調(diào)控作用，可影響細(xì)胞的分化、增殖及凋亡，從而影響多發(fā)性骨髓瘤的預(yù)后[20-21]。不過(guò)miRNAs在多發(fā)性骨髓瘤中的作用有一定的復(fù)雜性，在某種意義上從臨床組織得到的多發(fā)性骨髓瘤骨髓組織標(biāo)本無(wú)法真實(shí)反映出miRNAs的表達(dá)譜。再者限于患者數(shù)量少及收集標(biāo)本時(shí)間較短的原因，本次研究只納入了較少的病例，可能存在一定的研究偏倚，將在下一步進(jìn)行深入分析。

表2 前列腺癌患者預(yù)后死亡與miRNA-21等指標(biāo)的相關(guān)性

表3 影響多發(fā)性骨髓瘤患者預(yù)后死亡的因素

總之，miRNA-21在多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓中呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，與患者的血液學(xué)指標(biāo)顯著相關(guān)，可影響與預(yù)測(cè)患者的預(yù)后。