張楊蕊 龐 霞 黃 培 薛金慧

乳腺癌(breast cancer，BC)是多發(fā)病于女性的惡性腫瘤，且發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)[1]。目前乳腺癌的主要治療方法為外科手術(shù)，但是術(shù)后腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥、預(yù)后差等問題仍然是乳腺癌治療的難題[2]。已有研究表明[3]，特異性的分子靶向治療能夠有效提高惡性腫瘤治療效果以及改善患者預(yù)后，但是對(duì)于乳腺癌的分子靶向治療的研究尚不全面。

MicroRNA(miRNA)是一類長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸的小RNA，成熟的miRNA可被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，并且以不完全互補(bǔ)的方式與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'UTR)中的特定位點(diǎn)結(jié)合，以介導(dǎo)RNA的降解或抑制RNA的蛋白質(zhì)的翻譯[4]。已有研究表明，miRNA在腫瘤組織中差異表達(dá)，介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，例如，在腎細(xì)胞癌中，miR-425-5p的表達(dá)上調(diào)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞活力、侵襲和遷移[5]；在前列腺癌中，高miR-425-5p表達(dá)可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[6]。但是，miR-425-5p在乳腺癌中的作用仍然未知。本研究探究了miR-425-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞的作用，旨在為乳腺癌的分子治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺上皮細(xì)胞MCF10A(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)；乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所)；miR-425-5p mimic、miR-425-5p mimic NC、miR-425-5p inhibitor、miR-425-5p inhibitor NC(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；RNA轉(zhuǎn)染試劑盒(南京凱基生物技術(shù)有限公司)；PTEN小干擾RNA(siPTEN)(蘇州吉瑪基因股份有限公司)；PTEN質(zhì)粒(漢恒生物技術(shù)有限公司)；MTT檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞凋亡試劑盒(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)；PTEN抗體、山羊抗兔二抗(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)，RT-qPCR檢測(cè)試劑盒(沈陽萬類生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取液氮保存的MCF10A、MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20細(xì)胞，于37 ℃水浴鍋中快速解凍，加入等體積的含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基稀釋，1 000 rpm離心5 min，然后將細(xì)胞重懸，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 RT-qPCR檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中miR-425-5p的表達(dá)水平 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞至離心管中，加入Trizol裂解5 min，將200 μl氯仿加入上述裂解液，靜置5 min，12000×g，4 ℃離心15 min，取上層溶液，加入500 μl異丙醇，12000×g，4 ℃離心10 min，棄上清，1 ml 75%乙醇清洗RNA沉淀后，20 μl RNA-free水重懸RNA沉淀，55 ℃水浴10 min，即為總RNA，使用核酸定量?jī)x檢測(cè)總RNA含量。根據(jù)miRNA cDNA Synthesis 試劑盒指示配置反應(yīng)體系，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，然后利用核酸定量?jī)x對(duì)cDNA進(jìn)行定量。然后根據(jù)EvaGreen miRNA qPCR試劑盒指示配置反應(yīng)體系，進(jìn)行qPCR反應(yīng)，采用GAPDH作為內(nèi)參，反應(yīng)后采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-425-5p的表達(dá)量。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞接種于6孔板中，按照RNA轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，取3 μg的RNA用不含血清及雙抗的DMEM稀釋至100 μl，然后加入5 μl的RNA轉(zhuǎn)染試劑，靜置20 min后，稀釋至1 ml，并用上述混合液培養(yǎng)乳腺癌細(xì)胞8 h，然后更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。根據(jù)脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至70%時(shí)，按說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染PTEN質(zhì)粒。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將乳腺癌細(xì)胞調(diào)整至50000個(gè)/ml，將上述細(xì)胞接種至96孔板，每孔100 μl，每組3個(gè)復(fù)孔，并將細(xì)胞培養(yǎng)2～4 h，使乳腺癌細(xì)胞完全貼壁，然后每孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)37 ℃培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm處的吸光度，OD值越大，細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞遷移 調(diào)整細(xì)胞至5×104個(gè)/ml，并取200 μl細(xì)胞接種至Transwell小室中，每組3個(gè)復(fù)孔，小室放置于24孔板，24孔板每孔加入600 μl完全培養(yǎng)基，使小室底部浸入培養(yǎng)基，將24孔板于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，取出小室用PBS清洗，小室底部用無水乙醇固定30 min，晾干后用結(jié)晶紫對(duì)小室底部染色10 min，清洗晾干后，在顯微鏡下觀察拍照，每孔拍5張照片，并用Photoshop軟件計(jì)數(shù)，比較各組遷移的細(xì)胞數(shù)目，細(xì)胞數(shù)目越多，細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。

1.2.6 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因 使用miRDB和microT-CD 2個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選miR-425-5p的靶基因，取2個(gè)數(shù)據(jù)庫中的靶基因的交集，并使用Targetscan軟件根據(jù)數(shù)據(jù)庫提供的信息對(duì)靶基因進(jìn)行置信水平分析，取置信水平最高的靶基因。構(gòu)建GLS1野生型(pGL3-PTEN WT組)、突變型質(zhì)粒(pGL3-PTEN MUT組)以及空白質(zhì)粒(pGL3-control組)，并使用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將上述質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)293T細(xì)胞，再用RNA轉(zhuǎn)染試劑將miR-425-5p mimic和miR-425-5p mimic NC轉(zhuǎn)染至上述293T細(xì)胞，按照雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度。

1.2.7 Western blot檢測(cè)乳腺癌細(xì)胞中PTEN表達(dá)水平 取各組細(xì)胞加入125 μl的RIPA蛋白裂解液和5 μl的PMSF蛋白酶抑制劑，裂解30 min后，12000×r，4 ℃離心10 min，取上清，即為總蛋白。BCA蛋白定量后蛋白沸水浴加熱變性，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉2 h，然后以1∶1000比例稀釋后的PTEN、GAPDH一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育12 h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30 s，曝光并拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 MiR-425-5p在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、SKBR-3、MDA-MB-231、MDA-MB-468、BT-20中miR-425-5p表達(dá)水平均顯著高于乳腺上皮細(xì)胞MCF10A(P<0.05)，見圖1；提示乳腺癌細(xì)胞通過高表達(dá)miR-425-5p促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

注：與MCF10A相比，*P<0.05；*** P<0.001。

2.2 MiR-425-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示，相比于轉(zhuǎn)染MiR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimic組的MCF-7細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor組的MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力顯著下降，提示過表達(dá)miR-425-5p可促進(jìn)乳腺癌增殖能力。

2.3 MiR-425-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移能力的影響

細(xì)胞遷移檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，相比于miR-NC組，轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimic組的MCF-7細(xì)胞遷移能力顯著增加(P<0.001)，而轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor組的MDA-MB-231細(xì)胞遷移能力顯著下降，說明miR-425-5p能夠顯著促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的遷移能力。

2.4 MiR-425-5p能夠靶向結(jié)合PTEN

數(shù)據(jù)庫篩選結(jié)果顯示PTEN為miR-425-5p的靶基因，其靶向結(jié)合位點(diǎn)如圖4所示。雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTEN與miR-425-5p靶向關(guān)系結(jié)果顯示(圖5)，miR-425-5p mimic能夠使pGL3-PTEN WT組細(xì)胞熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.001)，而pGL3-Control組和pGL3-PTEN MUT組細(xì)胞熒光強(qiáng)度無顯著變化，說明PTEN為miR-425-5p的靶基因。

2.5 MiR-425-5p對(duì)PTEN蛋白水平表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果(圖6)顯示，在MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimic后PTEN表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.001)，轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor后PTEN表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.001)，說明miR-425-5p可抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)，進(jìn)而影響了乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

2.6 MiR-425-5p靶向PTEN促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖能力

CCK-8檢測(cè)結(jié)果(圖7)顯示，miR-425-5p mimic能夠顯著促進(jìn)MCF-7增殖能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染PTEN過表達(dá)質(zhì)粒后其增殖能力顯著低于miR-425-5p mimic組(P<0.05)，與對(duì)照組無顯著性差異(P>0.05)；miR-425-5p inhibitor能夠顯著抑制MDA-MB-231增殖能力(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染siPTEN抑制PTEN表達(dá)后細(xì)胞增殖能力顯著增加(P<0.05)，提示miR-425-5p能夠抑制PTEN的表達(dá)而提高乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。

2.7 MiR-425-5p靶向PTEN促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移能力

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果(圖8)顯示，miR-425-5p mimic顯著促進(jìn)MCF-7遷移(P<0.001)，過表達(dá)PTEN后MCF-7遷移能力顯著下調(diào)(P<0.001)；轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor顯著抑制MDA-MB-231遷移能力(P<0.01)，而抑制PTEN表達(dá)后細(xì)胞遷移顯著增加(P<0.05)，提示miR-425-5p能夠抑制PTEN的表達(dá)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)移能力。

注：與MiR-NC相比，*P<0.05；** P<0.01；*** P<0.001。

注：與MiR-NC相比，*** P<0.001。

圖4 miR-425-5p與PTEN結(jié)合區(qū)域預(yù)測(cè)結(jié)果及結(jié)合區(qū)域突變結(jié)果

注：與miR-NC組相比，***表示P<0.001。

注：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

根據(jù)2015年國(guó)家癌癥中心統(tǒng)計(jì)結(jié)果，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢(shì)，且逐漸趨于年輕化，國(guó)家癌癥研究機(jī)構(gòu)預(yù)計(jì)，截至2030年，乳腺癌的死亡率將上升至47.94%[7-8]。已有研究表明，術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤耐藥等均是導(dǎo)致乳腺癌高死亡率的原因，因此探究乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的機(jī)制對(duì)于乳腺癌的臨床治療至關(guān)重要。

隨著精準(zhǔn)醫(yī)療和分子診斷的發(fā)展，越來越多的研究將腫瘤的治療集中在基因水平，其中miRNA在調(diào)控腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮重要的作用，研究表明人類基因組中約有三分之一的基因受miRNA的調(diào)控，其作用機(jī)制主要是通過結(jié)合mRNA3'-UTR而抑制靶基因的表達(dá)，在基因的表達(dá)中起到負(fù)調(diào)控的作用，腫瘤組織miRNA的差異表達(dá)是調(diào)控腫瘤增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)進(jìn)程的重要因素[9-10]，例如[11]，miR-1299在三陰性乳腺癌中高表達(dá)而促進(jìn)腫瘤的增殖和遷移能力，miRNA-621調(diào)控乳腺癌的化療耐藥，而本研究發(fā)現(xiàn)miR-425-5p在5種乳腺癌細(xì)胞中均高表達(dá)，提示miR-425-5p作為差異表達(dá)的miRNA或可影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

注：與NC相比，** P<0.01；*** P<0.001；與miR-425-5p mimic組相比，# P<0.05，### P<0.001；與miR-425-5p inhibitor組相比，a P<0.05，aaP<0.001。

注：與NC相比，*** P<0.001；與miR-425-5p mimic組相比，### P<0.001；與miR-425-5p inhibitor組相比，aaaP<0.001。

本研究發(fā)現(xiàn)，在miR-425-5p表達(dá)量較低的乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimic 過表達(dá)miR-425-5p后MCF-7的增殖能力和遷移能力顯著增加；而在miR-425-5p表達(dá)較高的MDA-MB-231細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor抑制miR-425-5p表達(dá)后MDA-MB-231的增殖能力和遷移能力顯著降低，說明miR-425-5p對(duì)乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移均有顯著影響，或可作為乳腺癌治療或診斷的生物標(biāo)志物。

PTEN是抑癌基因家族中的一員，具有磷酸酯酶的活性，PTEN蛋白可通過拮抗酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。研究表明，將野生型PTEN基因轉(zhuǎn)染到該基因異常的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤后，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲能力受到明顯抑制，發(fā)現(xiàn)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的酪氨酸激酶FAK的活性有明顯的抑制作用。此外，PTEN蛋白還可通過特異性地使IP3的第三位磷酸去磷酸化而間接地抑制胰島素誘導(dǎo)的磷酸肌醇-3激酶的活性，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)[13-14]。

本研究通過數(shù)據(jù)可預(yù)測(cè)到PTEN可能為miR-425-5p的靶基因，并通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了PTEN和miR-425-5p的靶向關(guān)系，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-425-5p mimic的乳腺癌細(xì)胞PTEN表達(dá)顯著下調(diào)，而轉(zhuǎn)染miR-425-5p inhibitor的乳腺癌細(xì)胞PTEN表達(dá)顯著上調(diào)，而已有研究表明PTEN可調(diào)控腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，所以提示miR-425-5p或可通過抑制PTEN的表達(dá)而調(diào)控乳腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在MCF-7中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒過表達(dá)PTEN后，miR-425-5p mimic的促增殖和遷移作用則被逆轉(zhuǎn)；MDA-MB-231中抑制PTEN表達(dá)后，miR-425-5p inhibitor的抑制增殖和遷移作用亦被逆轉(zhuǎn)，說明PTEN作為miR-425-5p的下游靶基因調(diào)控乳腺癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，miR-425-5p能夠調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的體外生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能為抑制抑癌基因PTEN的表達(dá)。