梅 山，杜旭旭，楊朝云，史遠剛，淡新剛

（寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 750021）

Kisspeptin是由kiss1基因編碼的肽類激素，通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR54（也稱kiss1R）發(fā)揮作用。Kiss1被報道在非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞中表達，隨后被證明是抑制惡性黑色素瘤細胞轉(zhuǎn)移潛能的抑制因子［1］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，kisspeptin／GPR54直接或間接與神經(jīng)遞質(zhì)相互作用，調(diào)控促性腺激素釋放激素（GnRH）的釋放，在動物生殖內(nèi)分泌、初情期啟動及季節(jié)性繁殖中扮演著重要作用。Kisspeptin／GPR54信號系統(tǒng)還在外周組織中表達，參與卵巢功能的調(diào)節(jié)、胚胎植入、胎盤形成、血管生成、胰島素分泌等生物學(xué)過程。最近的諸多研究表明，kisspeptin在動物卵巢中發(fā)揮調(diào)控功能，包括卵泡發(fā)育成熟、顆粒細胞活力、類固醇合成等方面。文章闡述了kisspeptin／GPR54的生物學(xué)特性和kisspeptin／GPR54在動物卵巢中的定位分布，歸納了kisspeptin／GPR54在卵泡發(fā)育中的調(diào)控作用，突出強調(diào)了kisspeptin／GPR54在調(diào)控卵巢顆粒細胞活力及類固醇合成中的作用及其在細胞內(nèi)的相關(guān)信號通路。

1 Kisspeptin／GPR54簡介

編碼kisspeptin蛋白的kiss1基因位于人染色體lq32～41區(qū)域，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，前2個外顯子不翻譯；第3個外顯子是由38個非編碼堿基對構(gòu)成，后接轉(zhuǎn)錄起始位點和其余103個編碼堿基對；第4個外顯子中包含332個編碼堿基對、終止子和多腺苷酸化信號［1］。Kiss1編碼的初始肽類產(chǎn)物由145個氨基酸構(gòu)成，根據(jù)其水解后氨基酸鏈長度的不同可以分為kisspeptin 54、kisspeptin14、kisspeptin13、kisspeptin10，統(tǒng) 稱 為kisspeptins［2］。Kisspeptins家族及其包含的各級短肽都具有相同C端結(jié)構(gòu)Arg-Phe-NH2，屬于RF-酰胺化修飾結(jié)構(gòu)，具有類似的生物學(xué)活性。目前已經(jīng)克隆出很多物種kiss1基因的cDNA序列，包括人、牛、羊、猴、小鼠、大鼠和黑猩猩。通過氨基酸序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，人和其他靈長類動物的同源性高于85%，而人和嚙齒類動物之間同源性為45%～50%［3］。在1999年研究者發(fā)現(xiàn)，在人及鼠的大腦中kisspeptin是GPR54的一個配體，kisspeptins作為其天然配體，發(fā)揮調(diào)控作用的途徑就是通過激活其特異性受體GPR54來實現(xiàn)的［4］。人類的GPR54基因含有5個外顯子和4個內(nèi)含子，位 于19 號 染 色 體 上，別 名 AXOR12 或hoT7T175，其開放式閱讀框架包括398個氨基酸，可編碼的分子質(zhì)量為75 kD，其與甘丙肽及阿片受體家族具有一定的同源性［5］。J.Roa等［6］發(fā)現(xiàn)，人類GPR54同哺乳動物序列同源性相似程度較高，可達80%；但人與水生動物或兩棲動物相似程度偏低，僅為45%，可見GPR54在不同動物中較保守。

Kisspeptin及其受體GPR54在哺乳動物的各個組織器官中大量表達，其生物學(xué)功能最初被界定為抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，突變或無法正常表達kiss1基因可能會引發(fā)子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、膀胱癌等多種病癥，還與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)［7］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)是調(diào)節(jié)生殖活動中起關(guān)鍵作用的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)之一。Kisspeptin神經(jīng)元位于生殖軸的最上端，釋放的kisspeptin與其受體GPR54結(jié)合，促進GnRH的分泌，影響促卵泡素和促黃體激素的釋放，進而影響哺乳動物的各項繁殖性能，包括性別分化、青春期啟動、促性腺激素分泌的調(diào)節(jié)以及激素和環(huán)境對生育的控制［8］。除了在下丘腦-垂體-性腺軸起重要作用外，kisspeptin還參與動物機體代謝［9］、妊娠［10］、季節(jié)性發(fā)情［11］等一系列重要生理事件的調(diào)控。研究表明，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在調(diào)節(jié)動物機體各種生理過程中扮演著重要的角色。全面了解kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在生殖中的表達、功能及其潛在的分子機制將有助于生殖疾病的預(yù)防、診斷和治療。

2 Kisspeptin／GPR54在卵巢中的定位和表達

J.M.Castellano等［12］研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠發(fā)情周期的不同階段kisspeptin及其受體GPR54的編碼基因均表達，在初情期前的大鼠卵巢中kiss1mRNA水平較低，在初情期后的卵巢中kiss1mRNA水平顯著升高；在成年大鼠的卵母細胞、除無動情期外所有時期的顆粒細胞和間情期黃體中kiss1mRNA持續(xù)表達，在發(fā)情前期卵巢中表達水平開始升高，之后急劇下降，發(fā)情間期僅有少量增加。而GPR54mRNA水平在大鼠整個周期中保持在較低水平，沒有明顯的波動。F.Gaytan等［13］在人卵巢周期中檢測到了GPR54的表達，在生長卵泡中GPR54定位在生長卵泡的膜層，排卵后免疫染色定位在未完全黃素化的顆粒細胞中。在對西伯利亞倉鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，kisspeptin存在于卵泡中，在卵泡膜細胞和顆粒細胞中表達量較高，在動情前期和動情間期達到高峰；GPR54在腔前卵泡、腔內(nèi)卵泡及黃體中類固醇生成細胞中表達，在動情前期中的表達相對較強，而在動情間期中有所下降［14］。Z.Merhi等［15］研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin的表達與年齡相關(guān)，與幼齡小鼠相比，老年小鼠卵巢中的kiss1和GPR54mRNA水平顯著升高；在人類卵丘顆粒細胞中，GPR54mRNA水平與年齡呈正相關(guān)。M.E.Cielesh等［16］發(fā)現(xiàn)青春期前母犬卵巢中沒有kiss1表達，kiss1／GPR54在生殖周期的各個階段均存在于卵母細胞、顆粒細胞和黃體中，卵泡發(fā)育的不同階段不影響GPR54表達。P.Tanyapanyachon等［17］發(fā)現(xiàn)，kisspeptin及其受體GPR54在家貓各個時期的卵巢和子宮中均有表達，不同卵巢期間的定位分布無顯著差異。其他研究發(fā)現(xiàn)，GPR54在烏魚卵巢的表達從青春期中期開始顯著升高，是青春期早期的2倍［18］。

以上這些研究表明kisspeptin／GPR54在卵巢的分布具有顯著的時空特異性，在動物發(fā)情周期不同階段的分布不同，且kisspeptin／GPR54表達水平取決于發(fā)情周期的不同階段。Kisspeptin／GPR54在不同動物卵巢中具有高度保守的表達模式［19］。Kisspeptin／GPR54在性腺上可能以自分泌或旁分泌的方式參與動物卵泡發(fā)生［20］、卵母細胞成熟［21］、排卵［22］、顆粒細胞增殖凋亡［23-24］及類固醇合成［25］。

3 Kisspeptin／GPR54對卵泡發(fā)育的調(diào)控

3.1 Kisspeptin／GPR54直接調(diào)控卵泡發(fā)育

從幼年期到初情期，小鼠卵巢中kiss1mRNA的表達逐漸上調(diào)［26］。在初情期前，kiss1／GPR54敲除小鼠和正常小鼠的卵巢重量沒有顯著差異，在初情期后，kiss1／GPR54敲除小鼠與對照組小鼠相比卵巢重量和大小均顯著降低［27］。研究發(fā)現(xiàn)，GPR54單倍體缺陷小鼠，在初情期后一直到32周齡腔前卵泡數(shù)逐漸減少［28］。D.Fernandois等［20］報道，將kisspeptin或kisspeptin受體頡頏劑P234注入6，10月齡大鼠卵巢，結(jié)果表明，卵巢注入一定量kisspeptin可使有腔卵泡數(shù)減少，排卵前卵泡和黃體數(shù)增加；相反，卵巢注入P234后有腔卵泡數(shù)增加，而排卵前卵泡和黃體數(shù)減少。人抗苗勒氏管激素（AMH）主要由次級和小腔卵泡分泌，能夠抑制原始卵泡激活能力，是卵巢儲備的生物標志物［29］。在6，10月齡大鼠中，注射kisspeptin會增加血漿AMH，而P234會降低血漿AMH［20］。提示kisspeptin可能通過上調(diào)AMH和下調(diào)卵泡刺激素受體（FSHR）在卵巢中的表達來負向調(diào)節(jié)竇前（包括原始、初級和次級卵泡）卵泡的發(fā)育。在初情期后，kisspeptin可促進大卵泡的進一步發(fā)育成熟，增加排卵和黃體數(shù)量。

已有研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin可能在卵巢上以旁分泌和自分泌的方式參與卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟的調(diào)控。在綿羊中，添加kisspeptin的培養(yǎng)液中卵母細胞成熟比例顯著高于對照組；在添加kisspeptin的各組中，10μg／mL kisspeptin10可顯著提高體外培養(yǎng)的卵母細胞成熟率［30］。與綿羊卵母細胞體外培養(yǎng)的結(jié)果類似，在水牛卵母細胞體外培養(yǎng)中，添加10μg／mL kisspeptin10也能顯著增加卵丘細胞擴張率和第一極體排出率［31］。在豬上的研究發(fā)現(xiàn)，特定濃度的kisspepin不但能夠增加豬卵母細胞體外成熟率，而且也能促進早期胚胎發(fā)育率［21］。另外，卵泡內(nèi)的kisspeptin濃度與卵母細胞成熟密切相關(guān)［32］，在一些體外受精（in vitro fertilization，IVF）或卵巢過度刺激綜合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）患者中，kisspeptin54處理能夠促進卵母細胞成熟，并且較安全［33］。

C-mos基因能夠調(diào)節(jié)卵母細胞，通過激活細胞外信號調(diào)控蛋白酶調(diào)節(jié)成熟促進因子（MPF）的活性，c-mos還可通過抑制磷酸酶和激活下游信號通路促進胚泡破裂（GVBD）的發(fā)生［34］。已有的研究表明，在豬卵母細胞體外成熟過程中，c-mos基因表達逐漸升高［35］。GDF9和BMP15屬于TGFβ超家族成員，它們在卵母細胞和卵泡顆粒細胞中均有表達，并且其基因表達隨著卵泡發(fā)育及卵母細胞成熟而發(fā)生改變［36］。在體外培養(yǎng)中，添加一定濃度的GDF9和BMP15能夠提高卵母細胞體外成熟率［37］。研究表明，一定濃度kisspeptin10能夠上調(diào)豬卵母細胞中GDF9mRNA和BMP15mRNA基因的表達［21］。因此，kisspeptin可能直接作用于卵母細胞，通過上調(diào)卵母細胞中c-mos、GDF9和BMP15 mRNA的表達以提高卵母細胞的成熟率。然而，kisspeptin／GPR54直接對卵泡發(fā)育的作用，特別是腔前卵泡的發(fā)育還不清楚，kisspeptin／GPR54對卵泡發(fā)育的調(diào)控的分子機制尚未闡明，這需要做進一步研究。

3.2 Kisspeptin／GPR54間接調(diào)控卵泡發(fā)育

顆粒細胞是卵巢的主要功能細胞，顆粒細胞的生長發(fā)育在卵泡招募、選擇和成熟的生物學(xué)過程中起著至關(guān)重要的作用。在卵泡發(fā)育過程中顆粒細胞通過間隙連接，從周圍攝取各種營養(yǎng)物質(zhì)，促進卵泡生長。不同的細胞因子通過調(diào)控顆粒細胞上的促卵泡激素受體（FSHR）和雌激素受體（ER），促使卵泡進入生長期［38］。隨著卵泡的發(fā)育，顆粒細胞中芳香化酶的活性增強，會進一步提高雌激素濃度，刺激卵泡快速生長［39］。Kisspeptin在卵巢顆粒細胞中表達，通過其受體發(fā)揮作用，kisspeptin／GPR54可通過調(diào)控顆粒細胞活力及類固醇生成間接影響卵泡發(fā)育。

研究表明，kisspeptin10可以以劑量依賴方式極顯著提高雞卵巢顆粒細胞活力，促進孕酮合成［40］。在kisspeptin對牛卵巢顆粒細胞孕酮分泌影響的研究中也發(fā)現(xiàn)，kisspeptin10可以顯著提高牛顆粒細胞活力，100 nmol／L kisspeptin10處理牛卵巢顆粒細胞24 h后顆粒細胞孕酮水平顯著提高［23］。趙靜等［41］檢測了不同濃度kisspeptin10處理牛顆粒細胞不同時間后的細胞活力，發(fā)現(xiàn)不同濃度的kisspeptin10均可以極顯著提高牛卵巢顆粒細胞活力。Xin X.等［42］研究發(fā)現(xiàn)，在豬顆粒細胞中kiss1過表達可降低G0／G1期顆粒細胞的比例，顯著抑制顆粒細胞凋亡。張琳欽等［43］用kisspeptin10處理牦牛卵巢顆粒細胞，結(jié)果不同濃度kisspeptin10均能顯著提高顆粒細胞活力，且kisspeptin10對孕酮分泌呈劑量依賴性增加。另外在大鼠黃體細胞中，kisspeptin雖不影響3β-HSD mRNA轉(zhuǎn)錄，但能上調(diào)類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）和CYP11A的轉(zhuǎn)錄，且人體絨膜促性腺激素（hCG）能夠增強這一刺激效應(yīng)［25］。在兔黃體中，kisspeptin通過自分泌或旁分泌的方式增加孕酮的分泌［44］。G.K.Mishra等［45］研究發(fā)現(xiàn)，kisspeptin上調(diào)水牛卵巢顆粒細胞中黃體生成素（LHR）、STAR、3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）、芳香化酶P450（CPY11A1）的相對表達，提示kisspeptin在水牛黃體類固醇合成中起著的重要作用。kisspeptin在犬卵巢中具有局部調(diào)控作用，卵母細胞中的kisspeptin作用于顆粒細胞中的GPR54，刺激顆粒細胞中kiss1的表達，從而促進顆粒細胞的生長發(fā)育和孕酮的生成［16］。在人上，L.A.Owens等［46］研究發(fā)現(xiàn)，與傳統(tǒng)的卵母細胞成熟觸發(fā)因子hCG和GnRH相比，kisspeptin54作為卵母細胞成熟誘導(dǎo)因子，可以使人黃體細胞中與類固醇合成有關(guān)的基因（包括FSHR、LH／hCG受體、STAR、CPY19A1、雌激素受體α和雌激素受體β、3β-HSD和抑制素A基因）表達增強，這提示kisspeptin／GPR54也在人卵巢顆粒細胞類固醇合成中起關(guān)鍵作用。

綜上所述，在顆粒細胞中，kisspeptin通過提高顆粒細胞活力、上調(diào)類固醇合成關(guān)鍵酶基因表達促進顆粒細胞類固醇激素的合成，從而間接調(diào)控卵泡發(fā)育。

4 Kisspeptin／GPR54發(fā)揮生理作用的細胞內(nèi)信號通路

Kisspeptin與其受體GPR54結(jié)合，通過G蛋白介導(dǎo)激活細胞內(nèi)信號通路發(fā)揮生理作用。在GnRH細胞和下丘腦外植體中，GPR54在配體結(jié)合時激活磷脂酶C，隨后將磷脂酰肌醇二磷酸分解為三磷酸肌醇和二乙?；视汀Ｇ罢哒T導(dǎo)細胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存的Ca2＋外流，細胞內(nèi)Ca2＋的增加導(dǎo)致離子通道通透性的改變，從而引起去極化反應(yīng)；后者激活PKC，從而誘導(dǎo)MAPK激酶如ERK1／2和p38的磷酸化。二乙酰基甘油還通過激活非選擇性陽離子通道和抑制內(nèi)向整流鉀通道刺激GnRH去極化［47］。在垂體中，kisspeptin對垂體GPR54激活的刺激是由信號通路TOR、PI3、MAPK、PLC和細胞內(nèi)Ca2＋動員通路信號介導(dǎo)的，這與GPR54在Gn-RH神經(jīng)元的作用通路非常相似［48］。此外，GPR54的激活還可以通過Arrestin-1和Arrestin-2以相反的方式調(diào)節(jié)受體信號，Arrestin-1降低GPR54介導(dǎo)的ERK磷酸化，Arrestin-2增強ERK磷酸化［49］。在細胞模型中，GPR54信號的脫敏是由G蛋白偶聯(lián)受體中絲氨酸／蘇氨酸激酶2和βarrestin介導(dǎo)的結(jié)果［50］。

有研究發(fā)現(xiàn)，使用PLC抑制劑U73122及鈣離子抑制劑Verapamil能夠顯著抑制kisspeptin對雞卵巢顆粒細胞孕酮分泌的促進作用，提示kisspeptin在雞顆粒細胞中是通過調(diào)控PLC／Ca2＋來調(diào)控顆粒細胞孕酮合成的［40］。同時，在人卵巢顆粒細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，kisspeptin能夠誘導(dǎo)顆粒細胞內(nèi)Ca2＋濃度的動態(tài)變化，從而調(diào)控顆粒細胞功能，但具體機制仍不清楚［46］。另外，kiss1過表達可顯著增加豬顆粒細胞中PIK3CG、PIK3C1及PDK1基因的表達，而顯著降低PI3K信號通路中FOXO3、TSC2及BAD mRNA水平，說明kisspeptin可能通過激活PI3K信號通路抑制豬顆粒細胞凋亡［42］。

綜上所述，kisspeptin刺激GPR54存在多種信號通路，在不同細胞類型中，kisspeptin與受體GPR54結(jié)合后可能通過激活不同細胞內(nèi)通路，從而發(fā)揮生理作用，從一種細胞類型的信號通路推斷另一種細胞類型中的通路信號可能是行不通的。在卵巢顆粒細胞中，kisspeptin主要通過PLC／PKC／Ca2＋信號通路來調(diào)控顆粒細胞增殖分化、類固醇合成。然而，kisspeptin／GPR54在卵巢顆粒細胞中是否還存在其他信號通路仍需要做深入探索。

5 展望

近些年來，雖然大多數(shù)研究主要集中在kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在HPG軸中樞調(diào)節(jié)中的功能作用，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)在卵泡發(fā)育及顆粒細胞功能的調(diào)控中發(fā)揮了重要作用，然而kisspeptin／GPR54在其他諸多動物卵巢中的分布、定位及生理作用還不清楚。盡管已經(jīng)有充分證據(jù)表明kisspeptin／GPR54系統(tǒng)不僅在卵母細胞成熟中起著關(guān)鍵作用，而且kisspeptin／GPR54系統(tǒng)可促進卵巢顆粒細胞增殖和孕激素的分泌，但其作用機制目前尚不清楚。另外，除了kisspeptin在卵巢中以內(nèi)分泌或旁分泌的方式調(diào)控卵泡發(fā)育外，近些年也發(fā)現(xiàn)，kisspeptin／GPR54系統(tǒng)通過抑制血管內(nèi)皮細胞生長因子的表達增加OHSS患者卵巢血管通透性，提示kisspeptin／GPR54還可能以非類固醇方式調(diào)控卵巢功能［51］。將來可利用卵巢中特定的kiss1／GPR54基因敲除動物模型來系統(tǒng)、深入研究kisspeptin／GPR54在卵泡發(fā)育中的作用及調(diào)控機制。還需要在其他一些尚未開展研究的動物當中進一步探討kisspeptin／GPR54在卵巢中的定位、分布及作用。此外，kisspeptin及受體頡頏劑已開始在治療與女性不育相關(guān)的疾病和男性精子的活力中顯示出巨大的潛力［52］；然而其使用劑量、劑型及注射方式等方面仍需做進一步研究。