陳子方 沈凡藝 李江蕊 茍向薇 郭沛鑫

云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500

帕金森疾病(Parkinson’s Disease,PD)是一種復(fù)雜的神經(jīng)退行性疾病，多發(fā)于中老年人[1]。主要病因?yàn)槟X內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變性壞死致使多巴胺的含量相對(duì)不足，目前發(fā)病機(jī)制尚不明確[2-3]。雖然在PD早期階段有較好的對(duì)癥治療方法，但并不能逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性病變的進(jìn)程[4]。中藥天麻為蘭科天麻屬植物天麻(GastrodiaelataBl.)的根莖，有息風(fēng)定驚、平肝潛陽(yáng)等功效。近年來，關(guān)于天麻抗PD的研究報(bào)道較多[5-6]，但其有效成份尚不明確。本實(shí)驗(yàn)通過提取天麻成分，觀察天麻提取物對(duì)PD大鼠的治療作用，以期闡明中醫(yī)對(duì)于天麻善于“息風(fēng)定驚”的科學(xué)內(nèi)涵，明確其有效部位，為指導(dǎo)天麻治療PD的臨床合理用藥和開發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物 天麻提取物，由本實(shí)驗(yàn)室自制(制法：用搖擺式中藥粉碎機(jī)將天麻打粉至粗粉，用電子稱稱取天麻粗粉放入圓底燒瓶，分次加入5倍量95%乙醇回流提取3次(2 h∶1 h∶1 h)。合并3次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，將濃縮液加入熱水轉(zhuǎn)移，按照提取液：乙酸乙酯1∶1.5的比例加入乙酸乙酯萃取四次，合并下層水液，加熱濃縮，然后將濃縮液轉(zhuǎn)移至恒溫水浴鍋揮至浸膏狀，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中繼續(xù)干燥至恒重，即得)。美多芭(批號(hào)：SH2061，由上海羅氏制藥有限公司)。

1.2 動(dòng)物 SD大鼠，雄性，清潔級(jí)，體重250～350 g，由四川醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(川)2013-12。

1.3 試劑 6-羥基多巴胺(6-OHDA，批號(hào)：MKBX2602V，Aldrich公司)；阿撲嗎啡(Apomorphine，批號(hào)：LKF0204，Wako公司)。其余試劑均為分析純。

1.4 儀器 51500腦立體定位儀(Stoelting 公司)；BW-MIP906型微量注射泵(上海軟隆科技有限公司)；BW-SHD908型高速顱骨鉆(上海軟隆科技有限公司)；cence L 500臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Thermo Scientific)；101-OAB烘箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；UXF30086V63冰箱(海爾公司)。

2 方法

2.1 帕金森病大鼠模型的復(fù)制 將大鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射進(jìn)行麻醉，俯臥位固定于腦立體定位儀上，門齒低于耳桿2.3 mm，根據(jù)Paxson《The Rat Brain》圖譜，用6-OHDA行腦立體定位注射，制作PD大鼠模型。用0.2%抗壞血酸配制6-OHDA溶液(濃度：5 μg/μL)，將上述溶液分別注入右側(cè)黑質(zhì)致密部(SNc，坐標(biāo)為AP=-4.8 mm,ML=-1.2 mm,DV=-8.2 mm)和中腦腹側(cè)被蓋部(VTA，坐標(biāo)為AP=-4.8 mm,ML=-2.0 mm,DV=-8.0 mm)各4 μL，留針5 min，緩慢退針。傷口處涂抹硫酸慶大霉素，用人工骨蠟封閉顱骨鉆孔，縫合頭皮。造模14 d后，腹腔注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)誘導(dǎo)大鼠向健側(cè)轉(zhuǎn)圈，選取平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)≥7 r/min的大鼠作為造模成功大鼠[7]。

2.2 分組及給藥 取PD模型復(fù)制成功的大鼠隨機(jī)分為模型對(duì)照組(給予等體積蒸餾水)、美多芭組(7.8 mg/kg)、天麻提取物低劑量組(5 g生藥/kg)、中劑量組(10 g生藥/kg)、高劑量組(20 g生藥/kg)，每組8只。于每天早上8點(diǎn)按上述劑量定時(shí)灌胃給藥，灌胃體積為1 mL/100 g，連續(xù)灌胃給藥21 d。

2.3 行為學(xué)檢測(cè)

2.3.1 對(duì)阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響 在給藥期間，每7 d進(jìn)行1次行為學(xué)檢測(cè)，腹腔注射阿撲嗎啡(0.5 mg/kg)誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈，觀察其行為學(xué)變化，記錄注射5 min后30 min內(nèi)各組大鼠恒定向健側(cè)旋轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)圈數(shù)，以此評(píng)價(jià)藥物對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的改善作用[8]。

2.3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn)[9]Morris水迷宮為直徑1.2 m，高0.9 m的圓形水池，水池內(nèi)壁被漆為黑色，池內(nèi)水深0.5 m，水溫保持在(22±2)℃，房間內(nèi)光照恒定，無光線直射在水池內(nèi)。池壁上以4個(gè)等距離點(diǎn)將水池分為4個(gè)象限，在目標(biāo)象限(設(shè)為3象限)內(nèi)距離池壁35 cm處放有直徑為10 cm高23 cm的圓形黑色站臺(tái)，站臺(tái)位于水面下2 cm。池壁內(nèi)側(cè)貼有不同形狀的標(biāo)記物。迷宮上方安置連接顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。采用Smart2.0 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)進(jìn)行信息處理。

2.3.2.1 記憶訓(xùn)練期(第1～2 d) 將大鼠面朝池壁放入水中游泳60 s,第1天引導(dǎo)其登上平臺(tái)，第2天若在60 s內(nèi)動(dòng)物沒有登上平臺(tái)則繼續(xù)引導(dǎo)其登上平臺(tái)，停留15 s后放入溫暖干燥的籠子結(jié)束訓(xùn)練。

2.3.2.2 記憶增強(qiáng)期(第3～5 d) 每只動(dòng)物每天早晚各1次實(shí)驗(yàn)，每次分別從除平臺(tái)所在方位外的3個(gè)方位各放1次，每只動(dòng)物放入水中的間隔時(shí)間為15 s。動(dòng)物單次游泳時(shí)間為60 s，若大鼠在60 s內(nèi)不能上臺(tái)則引導(dǎo)其登上平臺(tái)適應(yīng)15 s后進(jìn)行下1次實(shí)驗(yàn)。最后將大鼠擦干放入鼠籠。

2.3.2.3 空間探索實(shí)驗(yàn)(第6 d) 撤除平臺(tái)，將大鼠從與平臺(tái)相對(duì)的方位面朝池壁放入水中，讓大鼠自由游泳60 s后將動(dòng)物擦干放入鼠籠。觀察大鼠在平臺(tái)所在象限的距離百分比(PT%)和停留時(shí)間百分比(T%)，以此來評(píng)價(jià)藥物對(duì)大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響(PT%和T%值越大，表明大鼠的認(rèn)知記憶能力越強(qiáng))。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠神經(jīng)行為學(xué)障礙的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，連續(xù)給藥7 d和14 d，天麻提取物各劑量組大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)與模型對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；連續(xù)給藥21 d，天麻提取物低劑量組(5 g生藥/kg)、中劑量組(10 g生藥/kg)和高劑量組(20 g生藥/kg)有降低阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠轉(zhuǎn)圈數(shù)的趨勢(shì)，但與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。上述結(jié)果可能與PD大鼠受損側(cè)腦區(qū)多巴胺受體的緩慢恢復(fù)有關(guān)。結(jié)果見表1、圖1。

表1 天麻提取物對(duì)阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠認(rèn)知功能障礙的影響

圖1 天麻提取物對(duì)阿樸嗎啡所誘導(dǎo)的PD大鼠認(rèn)知功能障礙的影響

3.2 水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型對(duì)照組比較，天麻提取物高劑量組(20 g生藥/kg)在水迷宮的平臺(tái)象限距離百分比(PT%)和停留時(shí)間百分比(T%)明顯增加，組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。天麻提取物低劑量組(5 g生藥/kg)和中劑量組(10 g生藥/kg)也能增加大鼠在水迷宮的平臺(tái)象限距離百分比(PT%)和停留時(shí)間百分比(T%)，但與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見表2、圖2。

表2 天麻提取物對(duì)水迷宮的平臺(tái)象限距離及時(shí)間百分比的影響

圖2 天麻提取物對(duì)水迷宮平臺(tái)象限PT%及T%的影響

4 討論

PD患者常伴隨著神經(jīng)行為學(xué)障礙的發(fā)生，改善神經(jīng)行為學(xué)障礙，使患者回歸社會(huì)，是藥物治療的重要目的[10]。在本次實(shí)驗(yàn)里，選擇了鹽酸去水嗎啡(APO)所誘導(dǎo)的PD大鼠旋轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和水迷宮實(shí)驗(yàn)來評(píng)價(jià)天麻提取物抗PD的作用。首先，在APO誘發(fā)PD大鼠旋轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)利用立體定位儀，參考大鼠的大腦立體圖譜，將6-OHDA定位注射到大鼠右側(cè)黑質(zhì)致密部和中腦腹側(cè)被蓋部，破壞黑質(zhì)-紋狀體DA系統(tǒng)，使動(dòng)物毀損側(cè)多巴胺能神經(jīng)元缺失、受損，導(dǎo)致多巴胺含量降低，表現(xiàn)為PD樣的癥狀[11-12]。此時(shí)，機(jī)體在受體調(diào)節(jié)機(jī)制下，受損側(cè)D2受體出現(xiàn)上調(diào)，產(chǎn)生超敏感現(xiàn)象，當(dāng)給予APO激動(dòng)D2受體后則產(chǎn)生比健側(cè)更強(qiáng)的DA活性，故而表現(xiàn)為向健側(cè)的旋轉(zhuǎn)。給藥后，藥物對(duì)腦內(nèi)神經(jīng)元起到保護(hù)作用，受損側(cè)腦區(qū)受體超敏現(xiàn)象得到改善，但此種改善是一個(gè)緩慢的過程，所以實(shí)驗(yàn)僅在給藥21d后觀察到大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)有下降的趨勢(shì)。在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，大鼠在目標(biāo)象限的距離百分比(PT%)和停留時(shí)間百分比(T%)數(shù)值越大，說明其空間學(xué)習(xí)記憶能力越好[13]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，天麻提取物高劑量(20 g生藥/kg)能明顯增加PD大鼠在目標(biāo)象限的距離百分比(PT%)和停留時(shí)間百分比(T%)(P<0.05)。

綜上，天麻提取物口服給藥，能增強(qiáng)PD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，明顯改善神經(jīng)行為學(xué)障礙，但其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。