胡向陽 李 安 林春淑 楊 璇

中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 珠海 519000

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)是指除過量飲酒和其他明確的損肝因素外，以肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞脂肪變性及肝小葉炎癥為特征的臨床病理綜合征[1]。近年相關(guān)腸道菌群失調(diào)、腸道屏障結(jié)構(gòu)破壞與肝病關(guān)系等研究，揭示NAFLD與“腸道菌群/腸道通透性增加-代謝性內(nèi)毒素血癥(Metabolic Endo-Toxemia)-炎癥因子(TNF-α)-肝臟脂肪變性/損傷”的病理途徑作用相關(guān)[2-3]。中醫(yī)認(rèn)為脂肪肝多為喜食肥甘厚味，久則脾失健運(yùn)，肝臟疏泄，痰濁瘀毒積結(jié)于肝而發(fā)病。小腸主泌別清濁，筆者認(rèn)為其“泌別”功能與“腸道屏障”,“清濁”與“腸道菌群內(nèi)毒素”等可衷中參西通融釋義。

三丫苦Melicopeptelefolia(Champ ex Benth)Hartley為蕓香科(Rutaeeae)蜜茱萸屬植物，又名三椏苦、三叉虎、三枝槍、三叉苦、三丫虎等，為灌木或小喬木，分布在廣東、廣西、海南、江西等地區(qū)及越南、泰國、馬來西亞等國家[4]。三丫苦是嶺南民間常用藥食同源藥，是廣東涼茶常用藥材。在越南、馬來西亞三丫苦葉是一種蔬菜沙拉，在泰國三丫苦嫩葉作為蔬菜和苦味滋補(bǔ)品[5]。三丫苦性味苦、寒，具有清熱解毒、行氣止痛、燥濕止癢的功效，主治熱病、咽喉腫痛、瘧疾、風(fēng)濕骨痛，外用治濕疹、皮炎和瘡瘍等，含有生物堿、黃酮、香豆素、植物甾醇等化合物，有抑菌抗炎、鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗氧化等作用[6-7]。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，中山、珠海群眾喜歡在春夏時(shí)令采集三丫苦葉，搗碎或冷泡取汁和大米粉攪拌蒸食，廣泛認(rèn)可它有清熱解毒功效。筆者對廣東三丫苦葉單方重用(30～80 g)或辨證組方使用，發(fā)現(xiàn)其對高脂血癥、非酒精性脂肪肝、高尿酸血癥等患者有臨床療效，且前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)廣東三丫苦葉水煎液對胰島素抵抗模型大鼠作用顯著[8-9]。本研究擬觀察三丫苦葉提取物對NAFLD大鼠小腸脂肪代謝作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和藥物 SPF級Wistar雄性大鼠48只，采購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重(140±10)g，動(dòng)物合格證號2017C117，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。非諾貝特，法國RECIPHARM FONTAINE生產(chǎn)，商品名力平之，每粒200 mg，批號H20160369，用生理鹽水溶解調(diào)整濃度50 mg/mL藥液備用。配置以每克三丫苦葉加水10 mL，浸泡1 h后煎煮，過濾藥液。使用FLT-U膜過濾系統(tǒng)過濾藥液，炭吸附并過濾除炭，設(shè)置60 ℃恒溫進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濕熱滅菌，制備含生藥10 g/mL藥液，4 ℃冰箱冷藏備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 高脂肪動(dòng)物食料、膽酸鈉、膽固醇、丙基硫氧嘧啶購于廣州天馬精細(xì)化工廠，膽固醇(TC)試劑盒、甘油三酯(TG)試劑盒購于南京建成生物試劑公司，RT-PCR儀(美國ABI公司)。DY89-I型電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)(寧波新芝)，LDZ5-2 型離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，AU600型全自動(dòng)生化分析儀(日本OLYMPUS株式會(huì)社)，分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司)。

1.3 動(dòng)物分組和造模 大鼠48只采用數(shù)字隨機(jī)法分為正常對照組、模型對照組、非諾貝特組、三丫苦葉提取物組，每組12只。參照文獻(xiàn)[10]各模型組連續(xù)8周給予大鼠高脂飲食飼養(yǎng)，正常組給予普通飲食。第9周開始給予各實(shí)驗(yàn)組大鼠藥物治療，灌服劑量非諾貝特組為100 mg·kg-1d-1；灌服劑量三丫苦葉提取物組為40 g·kg-1d-1，給予對照組和模型組等體積的生理鹽水，灌藥時(shí)間持續(xù)8周。

1.4 實(shí)驗(yàn)指標(biāo)檢測 各組大鼠禁食不禁水6 h，大鼠腹腔注射10% 水合氯醛麻醉后打開腹腔，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃，3000 rmp離心25 min分離血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測TC、TG。手術(shù)獲取肝臟，4 ℃生理鹽水沖洗去除薄膜，稱取肝濕重，采用公式：肝指數(shù)(%)=肝濕重/體重×100%計(jì)算肝指數(shù)。冰盤上剪取肝葉移入勻漿器，加入預(yù)冷的生理鹽水，研磨制備濃度10%的肝組織勻漿，3500 r/min離心15min獲取上清液，全自動(dòng)生化分析儀測定肝組織TC、TG。RT-PCR檢測小腸上皮細(xì)胞膜蛋白脂肪酸轉(zhuǎn)位酶(Cluster of Differentiation 36，CD36)、腸粘膜緊密連接閉鎖蛋白(Occludin)和腸粘膜緊密連接蛋白1(Zonula Occludens 1，ZO-1)的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用 SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件，多組間計(jì)量資料比較采用F檢驗(yàn)，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊的數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組血清TC、TG、肝TC、TG及肝指數(shù)比較 模型對照組與正常組比較，血清和肝TC、TG及肝指數(shù)均顯著增高(P<0.01)，表明NAFLD造模成功；非諾貝特組與模型對照組比較，血清和肝組織TC、TG及肝指數(shù)均有不同程度降低(P<0.01或P<0.05)；三丫苦提取物組與模型對照組比較，血清和肝組織TC、TG及肝指數(shù)有不同程度的降低(P<0.01或P<0.05)。三丫苦提取物組與非諾貝特組比較，肝TC有增高(P<0.05)。見表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組血清TC、TG、肝TC、TG及肝指數(shù)

2.2 各實(shí)驗(yàn)組小腸組織CD36、Occludin和ZO-1的表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型對照組小腸組織CD36顯著升高(P<0.01)，Occludin和ZO-1均顯著降低(P<0.01)。與模型對照組比較，非諾貝特組小腸組織Occludin和ZO-1有不同程度的升高(P<0.01或P<0.05)；三丫苦提取物組小腸組織CD36降低(P<0.01)，Occludin和ZO-1有不同程度的升高(P<0.01或P<0.05)。與非諾貝特組比較，三丫苦提取物組小腸組織CD36降低(P<0.05)。見表2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組小腸組織CD36、Occludin和ZO-1的表達(dá)比較

3 討論

NAFLD是臨床常見、發(fā)病率較高疾病，多無明顯癥狀，常在體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中無非酒精性脂肪肝的病名，歸屬于“肥氣病”“痰濁”“積聚”等范疇，中國NAFLD 患病率自2008～2018年激增至29.2%[11]。肝與腸道(中醫(yī)包括大腸、小腸)病理方面的聯(lián)系早在《內(nèi)經(jīng)》就有論述，如“陽明司天，燥淫所勝，病本于肝；陽明在泉所勝，民病喜嘔，嘔有苦,善太息，心肋痛；陽明之勝……左肋脅痛……外發(fā)頹疝；陽明之復(fù)……病生肋脅……善太息，腹脹而泄，甚則入肝，驚駭筋攣，太沖絕。”說明陽明大腸的病變可影響肝，致肝的疏泄失常?！鹅`樞·經(jīng)脈》載肝所生病可表現(xiàn)出“飧泄”。指出肝的疏泄失調(diào)，氣機(jī)不暢可導(dǎo)致大腸傳導(dǎo)失司而出現(xiàn)泄瀉的發(fā)生[12]。大腸主津、小腸主液，西醫(yī)統(tǒng)稱腸道消化系統(tǒng)，肝臟的生理功能借助于大腸降泄?jié)釟馐蛊浔３终?，而大腸的順利降濁又依賴肝疏泄功能的正常。腸道微生物群的生態(tài)失調(diào)及其誘導(dǎo)的代謝產(chǎn)物如膽汁酸、短鏈脂肪酸、內(nèi)源性乙醇以及膽堿相關(guān)代謝產(chǎn)物的失衡，炎性反應(yīng)和黏膜免疫功能受損可能是 NAFLD 發(fā)生發(fā)展的重要因素[13]。

傳統(tǒng)湯劑是中草藥療效研究的立足點(diǎn)，同時(shí)，傳統(tǒng)煎熬方式需要借助新技術(shù)改進(jìn)。膜分離技術(shù)使用超濾膜截留相對分子質(zhì)量5×103～5×105之間，中藥所含淀粉、樹脂、果膠等在5×104左右，有效成分多在1000以內(nèi)。膜分離方法可以分離中藥有效成，濾除雜質(zhì)的及淀粉、蛋白質(zhì)、樹脂等高分子，得到藥液色澤透亮，口感相對較好，保質(zhì)期延長[14]。TG吸收進(jìn)入小腸后被膽鹽乳化成微滴，后者在胰脂肪酶作用下水解為甘油一脂、脂肪酸等，經(jīng)過小腸絨毛表面屏障進(jìn)入靜脈，與血漿白蛋白結(jié)合后轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟[15]。CD36主要存在于十二指腸和空腸，對于小腸上皮細(xì)胞中長鏈脂肪酸的吸收有重要作用[16]。腸上皮細(xì)胞間主要連接方式是緊密連接，該結(jié)構(gòu)位于相鄰小腸上皮細(xì)胞膜之間，Occludin、ZO-1表達(dá)可以調(diào)控其鏈接功能[17]。Sellmann C等研究發(fā)現(xiàn)脂肪肝小鼠小腸組織Occludin和ZO-1表達(dá)下降，腸黏膜上皮屏障出現(xiàn)功能障礙[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NAFLD模型組大鼠大鼠血清和肝組織TC、TG及肝指數(shù)顯著升高，小腸組織CD36表達(dá)顯著升高，Occludin和ZO-1的表達(dá)均顯著降低，提示NAFLD大鼠在血清和肝血脂代謝異常同時(shí)，腸道LCFA吸收增加，腸黏膜上皮鏈接受損。經(jīng)過8周藥物治療，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)藥物組大鼠血清和肝TC、TG及肝指數(shù)均有不同程度的降低，兩組Occludin、ZO-1表達(dá)均有不同程度的增高，其中三丫苦提取物組CD36表達(dá)降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三丫苦葉提取物可以降低NAFLD大鼠血脂及肝脂水平，減輕腸道血脂代謝紊亂，其機(jī)制與干預(yù)腸道CD36、Occludin和ZO-1的表達(dá)有關(guān)。