高春燕，王朝江，李 慧，董文琦，高慶發(fā)

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051；2.靈壽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 石家莊 050500）

在食用菌生產(chǎn)時(shí)，常壓滅菌被廣泛應(yīng)用于熟料栽培和栽培菌種制作過程中，是非常關(guān)鍵的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，直接關(guān)系到栽培的成功與否。對(duì)常壓滅菌效果進(jìn)行檢測(cè)的理論方法很多，但由于實(shí)用性、可靠性較差且成本高等一些原因限制了其應(yīng)用。因此目前生產(chǎn)上主要依靠滅菌時(shí)間來判定常壓滅菌是否達(dá)標(biāo)，但由于滅菌料量等因素的影響，常導(dǎo)致滅菌不徹底。應(yīng)用常壓滅菌生物指示劑可以對(duì)食用菌生產(chǎn)中棉籽殼栽培料的常壓滅菌效果快速直觀監(jiān)測(cè)，使殺菌效率獲得穩(wěn)定提升，進(jìn)而提高栽培食用菌的生物轉(zhuǎn)化率。

1 棉籽殼常壓滅菌指示菌的獲得

選用含雜菌較多的栽培料，分散到細(xì)菌培養(yǎng)基中，并進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的常壓滅菌處理，篩選出最抗常壓滅菌的殘留菌。

1.1 雜菌含量高的栽培料配方

選用陳舊棉籽殼和麩皮，按照7∶3的比例將棉籽殼與麩皮混合均勻，烘干粉碎。

1.2 制備含雜菌細(xì)菌培養(yǎng)基

含雜菌細(xì)菌培養(yǎng)基配方：雜菌含量高的栽培料10%、蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、瓊脂粉1.5%。

制作時(shí)，用水提取栽培料中的雜菌，水用量為欲制作培養(yǎng)基量的70%，制成雜菌懸液；用剩余30%的水預(yù)溶其它組分，將菌懸液加入其它組分混合液中；分裝試管。

1.3 常壓蒸汽滅菌處理含細(xì)菌培養(yǎng)基試管

對(duì)含細(xì)菌培養(yǎng)基試管進(jìn)行常壓滅菌，處理時(shí)間從1 h開始，到14 h結(jié)束，按等差時(shí)長(zhǎng)進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的滅菌處理，最大時(shí)長(zhǎng)為殺死全部雜菌所需的時(shí)間。

1.4 室溫下恢復(fù)培養(yǎng)殘留菌

1.5 揀出最抗常壓滅菌的殘留菌

揀出達(dá)到完全殺菌狀態(tài)前最后出的單孢菌落，此菌即為最耐常壓滅菌的殘留菌。將該菌轉(zhuǎn)接到細(xì)菌培養(yǎng)基斜面試管上，培養(yǎng)留存。

1.6 檢驗(yàn)殘留菌在棉籽殼栽培料上的生長(zhǎng)能力

將殘留菌轉(zhuǎn)接到經(jīng)高壓滅菌的純棉籽殼培養(yǎng)基上，20℃～24℃溫度下培養(yǎng)。該菌在24 h～36 h內(nèi)能形成明顯大片菌落。表示該菌能在環(huán)境溫度（20℃～35℃）下，在棉籽殼培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)。

該殘留菌經(jīng)中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心鑒定為枯草芽孢桿菌。

2 指示菌常壓蒸汽滅菌效果的能力檢驗(yàn)

將殘留菌制成麩皮菌劑，把麩皮菌劑和棉籽殼栽培料轉(zhuǎn)接于細(xì)菌培養(yǎng)基上，進(jìn)行常壓滅菌，比較二者對(duì)常壓滅菌的抗力大小。

2.1 制備殘留菌麩皮菌劑

麩皮菌劑配方：麩皮、豆粉、磷酸氫二鉀、水的配比為 500∶100∶1∶440，混合均勻，121℃滅菌 2 h，接入殘留菌。經(jīng)培養(yǎng)、冷卻、干燥、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞滅活等過程，最后烘干至恒重，制成殘留菌麩皮菌劑。用平板計(jì)數(shù)法，把殘留菌麩皮菌劑的殘留菌芽孢數(shù)控制在106個(gè)/g。

2.2 檢驗(yàn)指示菌常壓蒸汽滅菌效果能力

2.2.1 檢驗(yàn)用細(xì)菌培養(yǎng)基

配方：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、瓊脂粉1.5%，制成斜面試管備用。

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2.2.2 檢驗(yàn)過程

將0.23 g的殘留菌麩皮菌劑和棉籽殼栽培料分別裝入制備好的斜面試管中。

對(duì)上述試管進(jìn)行100℃常壓滅菌，滅菌時(shí)長(zhǎng)分別為 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h，滅菌后直接擺放斜面20℃～24℃培養(yǎng)，觀察細(xì)菌恢復(fù)生長(zhǎng)情況。

棉籽殼栽培料滅菌3 h或4 h時(shí)已無菌長(zhǎng)出，麩皮菌劑滅菌7 h或8 h時(shí)仍有菌長(zhǎng)出，表明殘留菌比栽培料雜菌更具有抗常壓蒸汽滅菌的能力，即殘留菌被殺死時(shí)，栽培料中雜菌早已被殺死。證明其具有指示滅菌效果的能力。

3 棉籽殼常壓滅菌指示劑的制作

棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑由芽孢麩皮菌劑和用于指示菌恢復(fù)生長(zhǎng)的干培養(yǎng)基（無菌）組合而成，分裝在100 mL玻璃瓶?jī)?nèi)，裝入后密封。1個(gè)玻璃瓶即為1個(gè)指示劑。

3.1 繁殖指示菌

培養(yǎng)斜面試管菌種，所用斜面試管培養(yǎng)基為細(xì)菌培養(yǎng)基，劃線接種，36℃下培養(yǎng)48 h，獲得指示菌；將獲得的指示菌制成芽孢麩皮菌劑，方法參見2.1，將芽孢濃度調(diào)整為109cfu·g-1。

3.2 配制干粉培養(yǎng)基

1個(gè)（瓶） 指示劑中干粉培養(yǎng)基按40 mL計(jì)，各種材料的重量為蛋白胨0.40 g、酵母浸粉0.20 g、瓊脂粉0.80 g、葡萄糖0.20 g，氯化鈉0.32 g、磷酸氫二鉀0.08 g。

3.3 組配封裝

將1個(gè)（瓶） 指示劑干粉培養(yǎng)基和0.23 g芽孢麩皮菌劑（干培養(yǎng)基加水后，芽孢濃度106個(gè)/mL，無菌保證水平為10-6），放入玻璃瓶?jī)?nèi)，丁基膠塞、鋁蓋封口即制成1個(gè)（瓶）指示劑。

4 棉籽殼常壓滅菌指示劑的應(yīng)用

棉籽殼常壓滅菌指示劑與栽培料袋同時(shí)滅菌，滅菌后對(duì)指示劑瓶恢復(fù)培養(yǎng)，根據(jù)指示菌生長(zhǎng)情況，判定常壓滅菌效果。

4.1 指示劑瓶?jī)?nèi)注水

滅菌前，用一次性注射器往指示瓶?jī)?nèi)注入40 mL自來水、蒸餾水、礦泉水或井水均可，搖晃均勻。

4.2 指示瓶與栽培料同時(shí)滅菌

將指示劑瓶裝入將要滅菌的料袋中間位置，或者擠在料袋中間，含指示劑瓶的料袋或指示劑瓶應(yīng)放在距蒸汽管道出口較遠(yuǎn)、位置低、蒸汽最不宜達(dá)到的地方，并和栽培料袋一同滅菌。1 t栽培料（干重）建議用2個(gè)～3個(gè)指示瓶。

4.3 指示瓶培養(yǎng)

滅菌結(jié)束后，將指示劑瓶趁熱放置在自然環(huán)境下溫度最高（培養(yǎng)溫度20℃～40℃） 且遮陰的地方培養(yǎng)。若出鍋時(shí)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基已經(jīng)凝固，擺放時(shí)則隨凝固的形狀擺放，使凝固的培養(yǎng)基平面朝上擺放；此時(shí)若瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基還未凝固，需將瓶臥放使其凝固。

4.4 滅菌效果判定

指示劑瓶培養(yǎng)2 d～3 d后，若培養(yǎng)基表面出現(xiàn)大面積近白色不透明的菌落，表明該批次料滅菌不達(dá)標(biāo)；若培養(yǎng)基表面出現(xiàn)單個(gè)白色或近白色不透明的菌落，表明該批次料滅菌基本達(dá)標(biāo)；若不出現(xiàn)菌落，表示滅菌達(dá)標(biāo)。對(duì)滅菌不達(dá)標(biāo)的栽培料，如已接種應(yīng)加強(qiáng)通風(fēng)管理，特別是降低發(fā)菌溫度，防止雜菌爆發(fā)產(chǎn)生危害；未接種的建議重新滅菌；對(duì)基本達(dá)標(biāo)的栽培料，也應(yīng)加強(qiáng)通風(fēng)管理，降低發(fā)菌溫度，防止雜菌過快恢復(fù)生長(zhǎng)。另一方面，再滅菌時(shí)，應(yīng)延長(zhǎng)滅菌時(shí)間，降低料袋排列緊密程度，增加火力。

經(jīng)檢測(cè)玉米芯中的最耐熱菌抗熱能力略低于棉籽殼，因此本指示劑也適用于玉米芯為栽培主料的食用菌常壓滅菌效果監(jiān)測(cè)。本指示技術(shù)也可在高壓滅菌時(shí)應(yīng)用。