張 陽, 姜華茂

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科，遼寧 錦州 121000）

隨著病情的發(fā)展，絕大多數(shù)前列腺癌患者，最終會(huì)進(jìn)入 “去勢抵抗” 階段，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生存時(shí)間。目前，對去勢抵抗性前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer， CRPC） 尚 缺 乏規(guī)范有效的治療方法，因此迫切需要尋找有效的治療方法和藥物來延緩CRPC 的進(jìn)展。 川陳皮素（5， 6， 7， 8， 3'， 4'-hexameth-oxy flavone） 是一種多甲氧基黃酮類化合物，提取于陳皮［1］，具有抗腫瘤［2］、抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生［3］和抗神經(jīng)退行性病變［4］等 多 種 藥 理 作 用。已 有 研 究［5-7］表 明：川 陳皮素在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌和肝癌等細(xì)胞中具有一定程度的抗腫瘤作用，但川陳皮素在雄激素非依賴性前列腺癌DU145 細(xì)胞中的作用及其機(jī)制尚未明確。在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，MAPK 通路是非常關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPK 通路與細(xì)胞凋亡有密切關(guān)聯(lián)［8］， 其中磷酸化c-Jun 氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase， p-JNK）和磷酸化P38 絲裂原活化蛋白酶（phosphorylated P38 mitogen activated protease， p-P38） 可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9］， 而磷酸化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（phosphorylated extracellular regulated protein kinase，p-ERK） 可以抑制細(xì)胞凋亡［10］。本研究通過體外培養(yǎng)人前列腺癌DU145 細(xì)胞，并采用不同濃度川陳皮素處理DU145 細(xì)胞，研究其對前列腺癌DU145 細(xì)胞生長的抑制作用，并探討其作用機(jī)制，為去勢抵抗性前列腺癌尋找新的治療藥物并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞、藥物、主要試劑和儀器人前列腺癌DU145 細(xì)胞購自沈陽百思生物有限公司。川陳皮素（純度≥98%，批號H25A8K42328） 購自上海源葉生物科技有限公司。RPMI-1640 培養(yǎng)基和胰酶購自美國Gibco 公司，胎牛血清、超敏ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒和凝膠快速制備試劑盒均購自上海碧云天生物科技有限公司，MTT 粉末和脫脂牛奶購自北京索萊寶科技有限公司， DMSO 購 自 美 國Sigma 公 司， 一 抗JNK 、p-JNK、P38、p-P38、ERK、p-ERK 和GAPDH 及其對應(yīng)的二抗均購自北京博奧森生物科技有限公司，Transwell 小室和凋亡試劑盒購自沈陽萬類生物科技有限公司，Matrigel 基質(zhì)膠購自美國BD 公司， 全蛋白提取試劑盒購自上海BestBio 公司。CO2培養(yǎng)箱購自上海Blue Pard 儀器有限公司，蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜裝置購自美國Bio-Rad 公司，全波長酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan 貿(mào)易股份有限公司，流式細(xì)胞儀購自賽默飛世爾科技（中國） 有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)采用含10% 胎牛血清的RPMI-1640 完全培養(yǎng)基，于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37 ℃、5% CO2）中培養(yǎng)人前列腺癌DU145 細(xì)胞。

1.3 MTT法檢測各組人前列腺癌DU145細(xì)胞增殖活性取對數(shù)生長期人前列腺癌DU145 細(xì)胞100 μL （5×103μL－1） 接種于96 板孔中在細(xì)胞培養(yǎng)箱中（37 ℃、5% CO2） 培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后， 分別加入含有不同濃度（0、 0.8、 1.6、3.2、 6.4、 12.8、 25.6 和51.2 μmol·L-1） 川 陳 皮素的完全培養(yǎng)基作為不同濃度川陳皮素組，并設(shè)置對照組，對照組為含10% 胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基。在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24、48 和72 h，向培養(yǎng)基中加入MTT 溶液， 至MTT 終濃度為5 g·L－1，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，待MTT 被細(xì)胞攝取后，棄去MTT 液，向各孔加入150 μL DMSO，在酶聯(lián)反應(yīng)檢測儀上檢測各組細(xì)胞在570 nm 波長處的吸光度（A） 值，以細(xì)胞增殖活性表示川陳皮素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖的影響。細(xì)胞增殖活性=藥物組A 值/對照組A 值×100%。

1.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組人前列腺癌DU145細(xì)胞遷移能力取對數(shù)生長期人前列腺癌DU145 細(xì)胞接種于6 孔板中，每孔加入1.0×105個(gè)細(xì)胞，待細(xì)胞完全貼壁后，在孔中央橫軸方向采用200 μL 槍頭劃出1 條劃痕后分別加入不同濃度（0、 12.8 和25.6 μmol·L－1） 川陳皮素，倒置顯微鏡觀察劃痕狀態(tài)拍照后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)， 分別于6、12、24 和48 h 取樣，倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的劃痕狀態(tài)。以細(xì)胞劃痕愈合率代表川陳皮素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞遷移能力的影響。細(xì)胞劃痕愈合率= （初始細(xì)胞劃痕寬度－ 實(shí)際細(xì)胞劃痕寬度） /初始細(xì)胞劃痕寬度×100%。

1.5 Transwell法檢測各組人前列腺癌DU145細(xì)胞侵襲能力在24-Transwell 小室的上室均勻涂布1 g·L－1Matrigel 基質(zhì)膠，37℃下放置4 h，取對數(shù)生長期DU145 細(xì)胞， 消化后稀釋密度為1×105mL－1細(xì) 胞 懸 液 加 入24-Transwell 小 室 的 上室，隨機(jī)分為對照組、12.8 μmol·L－1川陳皮素組和25.6 μmol·L－1川 陳 皮 素 組， 24-Transwell 小 室的下室加入含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子，置于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。取出上室，采用0.1% 結(jié)晶紫染色并清除未侵襲的細(xì)胞，然后對侵襲的細(xì)胞進(jìn)行拍照，采用ImageJ 軟件進(jìn)行圖像分析。以相對侵襲細(xì)胞數(shù)表示川陳皮素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞侵襲能力的影響。

1.6流式細(xì)胞術(shù)檢測各組人前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡率對照組、 12.8 μmol·L－1川陳皮素組和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后采用胰蛋白酶消化后PBS 漂洗2 次，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)， 離心收集5×105個(gè)細(xì)胞， 加入500 μL Binding buffer 重懸細(xì)胞，加入5 μL APC 混勻后，加入10 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，1 h 內(nèi)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率= （早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)） /細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 Western blotting法檢測各組細(xì)胞中p-JNK、p-P38和p-ERK蛋白表達(dá)水平人前列腺癌DU145 細(xì)胞經(jīng)川陳皮素作用48 h 后，采用胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 洗滌2 次，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min，BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度。每孔按10 μg 蛋白樣品上樣， 12% SDS-PAGE 分離蛋白，80 V 恒壓濕轉(zhuǎn)30 min 后轉(zhuǎn)110 V 恒壓濕轉(zhuǎn)60 min，300 mA 恒流轉(zhuǎn)膜90 min，5% 脫脂牛奶封閉2 h ， 然 后 分 別 用p-JNK （1 ∶500）、 p-P38（1 ∶500）、p-ERK （1∶500） 一抗4℃搖床孵育過夜12 h， HRP 標(biāo) 記 的 二 抗（1 ∶5 000） 室 溫 孵育2 h，ECL 顯影液顯影，凝膠成像系統(tǒng)拍照并采用Image J 軟件進(jìn)行圖像分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白（GAPDH） 條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達(dá)水平。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組細(xì)胞增殖活性、劃痕愈合率、侵襲細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞中p-JNK、p-P38 及p-ERK 蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)。 檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié) 果

2.1各組人前列腺癌DU145細(xì)胞增殖活性0.8、1.6、 3.2、 6.4、 12.8、 25.6 和51.2 μmol·L－1川陳皮素處理人前列腺癌DU145 細(xì)胞24、48 和72 h后，人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖活性隨著藥物濃度的加大而降低，呈現(xiàn)時(shí)間和濃度依賴性。作用48 h 后，川陳皮素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（inhibitory concentration 50， IC50） 約為51.2 μmol·L－1，因此以下實(shí)驗(yàn)用藥濃度不超過51.2 μmol·L－1， 后 續(xù) 實(shí) 驗(yàn) 用 藥 濃 度 選 擇25.6 和12.8 μmol·L－1。見圖1。

圖1 MTT 法檢測各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞增殖活性Fig.1 Proliferation activities of human prostate cancer DU145 cells in various groups detected by MTT method

2.2各組人前列腺癌DU145細(xì)胞遷移形態(tài)表現(xiàn)和劃痕愈合率處理人前列腺癌DU145 細(xì)胞6、12、24 和48 h 后，12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細(xì)胞劃痕愈合率較對照組明顯降低（P＜0.01），并且細(xì)胞劃痕愈合率隨著藥物濃度的增多而降低，呈現(xiàn)濃度依賴性。各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞遷移形態(tài)表現(xiàn)見圖2 （插頁八），各組胞劃痕愈合率見圖3。

圖3 各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞劃痕愈合率Fig.3 Scratch healing rates of human prostate cancer DU145 cells in various groups

2.3各組人前列腺癌DU145細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)處理48 h 后， 12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組明顯降低（P＜0.01），且其侵襲細(xì)胞數(shù)隨著藥物濃度的增加而降低。見圖4 （插頁八） 和圖5。

圖5 各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)Fig.5 Number of invasion cells of human prostate cancer DU145 cells in various groups

2.4各組人前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡率處理48 h 后，12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前列腺癌DU145 細(xì)胞凋亡率較對照組明顯升高（P＜0.01），并且細(xì)胞凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加。見圖6 和圖7。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞凋亡率Fig.6 Apoptotic rates of human prostate cancer DU145 cells in various groups detected by flow cytometry

2.5各組人前列腺癌DU145細(xì)胞中p-JNK、p-P38和p-ERK蛋白表達(dá)水平作用48 h 后，與對照組比較，12.8 和25.6 μmol·L－1川陳皮素組人前腺癌DU145 細(xì)胞中p-JNK 和p-P38 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）， p-ERK 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.01）。見圖8 和圖9。

3 討 論

前列腺癌是美國男性中最常見的惡性腫瘤［11］。但是在發(fā)展中國家，這類癌癥的發(fā)病率也呈逐年升高［12］。這可能與人均壽命的延長、飲食結(jié)構(gòu)的改變和診斷技術(shù)的不斷提高有密切關(guān)聯(lián)。目前，早期前列腺癌應(yīng)用根治性手術(shù)或根治性放療均可以有效控制其發(fā)展［13-14］。大部分局部進(jìn)展期前列腺癌和轉(zhuǎn)移性前列腺癌一般選擇雄激素去勢治療為主的姑息性治療［15］。絕大多數(shù)前列腺癌患者經(jīng)過手術(shù)或者藥物去勢治療之后，在一定時(shí)間內(nèi)，腫瘤生長均能得到一定程度的抑制。但是隨著病情的進(jìn)展，最終會(huì)進(jìn)入 “去勢抵抗” 階段［16］。而目前針對去勢抵抗性前列腺癌， 尚缺少統(tǒng)一規(guī)范的治療方法［17］。一般可選擇的方法有化療、 免疫治療和靶向治療［18］。這3 種治療方式價(jià)格昂貴，但是療效卻不是十分明顯，而且化療的不良反應(yīng)也較多，患者依從性差。因此，迫切需要尋找針對去勢抵抗性前列腺癌治療的新方法。

圖7 各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞凋亡率Fig.7 Apoptotic rates of human prostate cancer DU145 cells in various groups

圖8 Western blotting 法檢測各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞中p-JNK、p-P38 和p-ERK 蛋白表達(dá)電泳圖Fig.8 Electrophoregram of expressions of p-JNK,p-P38, and p-ERK proteins in human prostate cancer DU145 cells in various groups detected by Western blotting method

圖9 各組人前列腺癌DU145 細(xì)胞中p-JNK、p-P38 和p-ERK 蛋白表達(dá)水平Fig.9 Expression levels of p-JNK, p-P38, and p-ERK proteins in human prostate cancer DU145 cells in various groups

天然產(chǎn)物或植物來源的生物活性化合物已經(jīng)在癌癥化療中獲得了越來越多的關(guān)注，因?yàn)槠浔徽J(rèn)為具有更高的生物反應(yīng)性和與靶點(diǎn)的協(xié)同進(jìn)化性，對正常細(xì)胞的毒性也較小［19］。陳皮是從柑橘屬植物中培育出來的一種成熟的果皮，其中主要生理活性成分——川陳皮素，具有多種藥理作用，主要包括抑制腫瘤生長、抑制炎癥介質(zhì)產(chǎn)生、抑制氧化應(yīng)激、抗糖尿病胰島素抵抗、保護(hù)骨骼、減少骨吸收、抗過敏、抗心血管功能紊亂和抗神經(jīng)退行性病變等作用。已證實(shí)其在甲狀腺癌［20］、肺癌［21］、膀胱 癌［22］、 腎 癌［23］、 鼻 咽 癌［24］和 口 腔 鱗 狀 細(xì) 胞癌［25］等組織中均有明顯的抑癌作用。在人前列腺癌細(xì)胞中，較常用于研究的有LNCaP 細(xì)胞（激素依賴性）、PC3 細(xì)胞（雄激素非依賴性） 和DU145細(xì)胞（雄激素非依賴性），其中DU145 細(xì)胞的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能最高，同時(shí)是一種不含雄激素受體的細(xì)胞株，主要用于晚期去勢抵抗性前列腺癌研究［26］。本課題組通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了川陳皮素對人前列腺癌DU145 細(xì)胞具有抗腫瘤作用。川陳皮素不僅可以抑制前列腺癌DU145 細(xì)胞的生長，降低其遷移能力和侵襲能力，并且可以促進(jìn)DU145細(xì)胞凋亡。前列腺癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)聯(lián)，其中MAPK 就是非常關(guān)鍵的一條通路。MAPK 中ERK 是目前研究最深入的信號通路，其與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)，而JNK 和P38主要與細(xì)胞凋亡有關(guān)聯(lián)。

經(jīng)過不同濃度（0、12.8 和25.6 μmol·L－1） 川陳皮素處理人前列腺癌DU145 細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞中p-JNK 和p-P38 的表達(dá)水平明顯升高，而P-ERK的表達(dá)水平降低， 提示川陳皮素在人前列腺癌DU145 細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用，其抑制細(xì)胞生長、促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用可能與MAPK 途徑上相關(guān)蛋白表達(dá)的改變有密切關(guān)系，但是這一機(jī)制需要通過抑制劑進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上所述，川陳皮素在人前列腺癌DU145 細(xì)胞中有良好的抗癌活性，是潛在的治療前列腺癌的藥物，但未來需要對川陳皮素用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作用進(jìn)行進(jìn)一步研究。