賈雪冰, 孫孟菲, 姚 莉, 劉 暢, 董 茵, 黃日祥, 柏 亮, 唐 晨, 申延琴, 崔 春

（1.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，江蘇 無(wú)錫 214122；2.江南大學(xué)無(wú)錫醫(yī)學(xué)院神經(jīng)退行和損傷研究室，江蘇 無(wú)錫 214122）

神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells， NSCs） 具有自我更新和分化成神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的能力［1］。因NSCs 在維持腦內(nèi)穩(wěn)態(tài)和修復(fù)腦內(nèi)損傷細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，使得NSCs 移植對(duì)于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好前景。研究［2-3］表明：NSCs移植可以延緩衰老，治療帕金森病、阿爾茲海默癥和多發(fā)硬化等疾病。成年人NSCs 主要分布于大腦海馬齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ） 和側(cè) 腦 室 室 下 區(qū)（subventricular zone， SVZ）［4］。 最近的研究［5］表明：下丘腦作為調(diào)節(jié)機(jī)體生理狀態(tài)的中心，同樣存在著NSCs。LEE 等［6］研究新出生和成年小鼠下丘腦區(qū)域發(fā)現(xiàn)：下丘腦存在可以持續(xù)增殖的細(xì)胞，并且增殖的細(xì)胞表達(dá)NSCs 的標(biāo)記物Nestin 和Sox2，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些新生細(xì)胞與機(jī)體新陳代謝有關(guān)聯(lián)。研究［7-8］表明：大腦不同區(qū)域的神經(jīng)發(fā)生具有特定分化傾向和功能特異性，海馬SGZ 區(qū)NSCs 分化形成的神經(jīng)元主要遷移至齒狀回的顆粒細(xì)胞層成為齒狀顆粒細(xì)胞，發(fā)揮學(xué)習(xí)、記憶和情緒調(diào)節(jié)等功能，而SVZ 區(qū)NSCs 分化形成的神經(jīng)元?jiǎng)t進(jìn)行長(zhǎng)距離的遷移，到嗅球區(qū)域形成顆粒細(xì)胞層的顆粒細(xì)胞和小球?qū)拥男∏蛑芗?xì)胞，發(fā)揮嗅覺(jué)和學(xué)習(xí)等功能［9-10］。SGZ 和SVZ 神經(jīng)發(fā)生的特定分化傾向和功能特異性受到神經(jīng)遞質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞內(nèi)機(jī)制的影響［4］，但關(guān)于下丘腦神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制尚不明確。

目前干細(xì)胞移植治療已經(jīng)應(yīng)用于臨床治療，并取得較好的治療效果，研究［11］集中于海馬干細(xì)胞的移植。關(guān)于下丘腦NSCs 移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究鮮有報(bào)道，且下丘腦和海馬作為NSCs的來(lái)源在蛋白表達(dá)方面是否存在差異尚未見(jiàn)研究報(bào)道，因此本文作者通過(guò)體外培養(yǎng)小鼠原代下丘腦和海馬NSCs，采用蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究下丘腦和海馬NSCs 在蛋白表達(dá)方面的差異，為下丘腦NSCs研究和NSCs 移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供更多的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器12 只出生24 h 內(nèi)的SPF 級(jí)雄性C57BL/6J 小鼠（蘇州昭衍新藥研究中心有限公司），動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK （蘇） 2018-0006。Neurobasal-A 培養(yǎng)基、 磷 酸 鹽 緩 沖 液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4）、 TrypLE ? Express 酶、 B-27 Supplement、 D-Hank’s液、 表 皮 生 長(zhǎng) 因 子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，b-FGF）、GlutaMAX 和青霉素-鏈霉素（美國(guó)Gibco 公司），Hepes 溶液、 多聚賴氨酸和層黏連蛋白（美國(guó)Sigma 公司），PBS 粉（北京索萊寶公司），多聚甲醛和葡萄糖（國(guó)產(chǎn)分析純），F(xiàn)ITC 羊抗小鼠二抗、Cy3 羊抗兔二抗和DAPI （上海碧云天公司），兔來(lái)源Sox2 抗體（美國(guó)Millipore 公司），鼠來(lái)源Nestin抗體（美國(guó)Abcam 公司）。正置顯微鏡（德國(guó)蔡司公司），體式顯微鏡（美國(guó)Motic 公司），串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽（tandem mass tag，TMT） 標(biāo)記試劑盒、QExactive 質(zhì)譜儀和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LCMS/MS）分析系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher 公司），6 孔培養(yǎng)皿、60 mm 培養(yǎng)皿和100 mm 培養(yǎng)皿（美國(guó)Thermo Fisher 公司）， 35 mm 共聚焦皿（美國(guó)Nunc 公司）。

1.2原代NSCs的提取和培養(yǎng)

將出生24 h 內(nèi)的乳鼠經(jīng)75% 酒精消毒后，采用剪刀斷頭處死，在無(wú)菌環(huán)境中解剖出整腦組織，采用Solution A溶液（D-Hank’s 溶液含30 mmol·L－1葡萄糖、2 mmol·L－1Hepes 溶液和26 mmol·L－1的NaHCO3） 洗滌3 次，將整腦組織置于盛有預(yù)冷的Solution A 溶液的培養(yǎng)皿中，在體式顯微鏡下解剖出海馬和下丘腦，將海馬和下丘腦剪切成1 mm×1 mm×1 mm 的小塊，采用TrypLE?Express 酶在37℃環(huán)境下消化組織25～30 min，PBS 終止消化，反復(fù)吹打消化組織，200 目細(xì)胞篩過(guò)濾，室溫200 g離 心 5 min 棄 去 上 清， 采 用 IPM 培 養(yǎng) 基（Neurobasal-A 培 養(yǎng) 基 中 含2% B27， 20 μg·L－1EGF，10 μg·L－1b-FGF，0.24% GlutaMAX，1%雙抗） 重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，以5×105mL－1的細(xì)胞密度鋪于6 孔板中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 d換去一半IPM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)［12］。

1.3 NSCs的傳代培養(yǎng)

分離培養(yǎng)的原代NSCs 培養(yǎng)5～7 d 后，在顯微鏡下可見(jiàn)大量懸浮的神經(jīng)球，收集含有神經(jīng)球的培養(yǎng)液，室溫200 g 離心5 min 收集細(xì)胞，37℃環(huán)境下TrypLE?Express 酶消化細(xì)胞10 min，PBS 終止消化，將神經(jīng)球吹打成單細(xì)胞懸液，室溫200 g 離心5 min 收集細(xì)胞，采用IPM 培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后以1×105mL－1的細(xì)胞密度進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。

1.4免疫熒光法檢測(cè)NSCs形成的神經(jīng)球中Nestin和Sox2的表達(dá)

傳代1 次的NSCs （P1 代） 形成神經(jīng)球后，室溫200 g 離心5 min 收集細(xì)胞，IPM 培養(yǎng)基重懸后，接種于預(yù) 先 包 被0.1 g·mL－1多 聚 賴 氨 酸 和1 g·mL－1層黏連蛋白包被的35 mm 共聚焦皿中，培養(yǎng)24 h 使神經(jīng)球貼壁生長(zhǎng)， 然后棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌3 次， 4% 多聚甲醛固定神經(jīng)球20 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min，0.l% Triton X-100 通透細(xì)胞10 min，PBS 洗滌3 次，每次2 min，5% 山羊血清在37℃封閉細(xì)胞30 min，棄去封閉液，加入小鼠抗Nestin （1∶100） 單克隆抗體和兔抗Sox2（1∶250） 單克隆抗體，4℃孵育過(guò)夜，棄去抗體，PBS 洗滌3 次，每次2 min，加入FITC 標(biāo)記的羊抗鼠（1∶1 000） 和Cy3 標(biāo)記的兔抗羊（1∶1 000）二抗37℃孵育細(xì)胞1 h，PBS 洗滌3 次，每次2 min，DAPI （1∶1 000） 室溫 孵 育15 min ， PBS 洗 滌3 次， 每次2 min， 熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)球中Nestin 和Sox2 表 達(dá) 信 號(hào)。

如果在A中?q∈Q,?B∈2AP都有|δ(q,B)|=1，那么A是一個(gè)完全的DFA.一個(gè)完全的DFA對(duì)于每個(gè)輸入字σ∈(2AP)ω都存在一個(gè)唯一的運(yùn)行與之對(duì)應(yīng).

待培養(yǎng)的傳代2 次（P2 代） NSCs 形成神經(jīng)球后，采用步驟 “1.3” 方法將P2 代神經(jīng)球經(jīng)酶消化成單細(xì)胞，采用IPM 培養(yǎng)基將單細(xì)胞培養(yǎng)在經(jīng)多聚賴氨酸和層黏連蛋白包被的35 mm 共聚焦皿中，培養(yǎng)24 h 使細(xì)胞貼壁，然后依據(jù)步驟 “1.4” 采用免疫熒光法檢測(cè)NSCs 中Nestin 和Sox2 的表達(dá)，同理檢測(cè)傳代3 次（P3 代） 和傳代4 次（P4 代）NSCs 中Nestin 和Sox2 的表達(dá)。采用熒光顯微鏡采集NSCs 中Nestin 和Sox2 表 達(dá) 信 號(hào) 后， 計(jì) 算Sox2+/DPAI 和Nestin+/DPAI，以此代表Nestin 和Sox2 的陽(yáng)性表達(dá)率。

1.5蛋白質(zhì)組學(xué)法分析下丘腦和海馬組織NSCs中蛋白表達(dá)

1.5.1 下丘腦和海馬組織中NSCs 總蛋白的提取P4 代 海 馬 的NSCs 設(shè)3 個(gè) 重 復(fù) 樣， 分 別 為HI1、HI2 和HI3， P4 代 下 丘 腦 的NSCs 設(shè)3 個(gè) 重 復(fù) 樣，分別為HY1、HY2 和HY3，收集培養(yǎng)的P4 代海馬和下丘腦組織中NSCs，室溫200 g 離心5 min 收集NSCs，加 入4℃預(yù) 冷 的PBS ， 重 懸 細(xì) 胞， 4℃、200 g 離心5 min，棄去上清，加入預(yù)冷的SDT 裂解液，超聲裂解，25℃、14 000 g 離心40 min 收集沉淀，采用BCA 法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，將樣品保存于－80℃。

1.5.2 TMT 標(biāo)記實(shí)驗(yàn) 將 “1.5.1” 步驟提取的6 組NSCs 總蛋白采用FASP 法用胰蛋白酶酶解成肽段，經(jīng)酶標(biāo)儀于280 nm 處進(jìn)行定量檢測(cè)肽段吸光 度（A） 值， 每 組 分 別 取100 μg 肽 段， 采 用TMT 試劑進(jìn)行標(biāo)記。

1.5.3 高pH 反相肽段分級(jí)的檢測(cè) 將每組標(biāo)記后的肽段等量混合后通過(guò)高反相分級(jí)，具體方法：采用乙腈和0.1% 三氟乙酸進(jìn)行柱平衡，將標(biāo)記后的肽段樣品上樣，加入純水后低速離心進(jìn)行脫鹽處理，采用梯度濃度的高pH 乙腈溶液對(duì)柱結(jié)合肽進(jìn)行梯度洗脫， 洗脫的肽段樣品真空干燥后采用12 μL 0.1% 三氟乙酸復(fù)溶凍干樣品，測(cè)定肽段濃度后備用。

1.5.4 高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry ，LC-MS/MS）分析 分級(jí)后的肽段樣品采用納升流速的HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC 進(jìn)行分離。色譜柱以95% 的緩沖液（0.1% 甲酸水溶液） 平衡，樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱，以300 nL·min－1的流速經(jīng)過(guò)分析柱分離。

樣品經(jīng)色譜分離后采用Q-Exactive 質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。檢測(cè)方式為正離子母離子，掃描范圍為300～1 800 m·z－1， 一 級(jí) 質(zhì) 譜 分 辨 率 為70 000（200 m·z－1），最大離子注入時(shí)間為50 ms，動(dòng)態(tài)排除時(shí)間為60 s。每次全掃描后采集20 個(gè)碎片圖譜（MS2 scan）， MS2 激 活 類 型 為HCD ， 隔 離窗 口 為2 m·z－1， 二 級(jí) 質(zhì) 譜 分 辨 率 為17 500（200 m·z－1），共進(jìn)行15 個(gè)1 h 的LC-MS 分析，得出原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)。

1.5.5 蛋白質(zhì)信息的匯總 采用Moscot 2.2 和Proteome Discoverer 1.4 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索和定量分析， 按照過(guò)濾參數(shù)FDR ＜0.01 合并所有定量和定性蛋白質(zhì)分析結(jié)果。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5.6 生物信息學(xué)分析 對(duì)倍數(shù)變化＞1.2 倍且P＜0.05 的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括基因本體（Gene Ontology，GO） 分析和基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 分析。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。下丘腦和海馬組織NSCs 中Nestin 和Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率、下丘腦和海馬組織NSCs 中差異蛋白質(zhì)的表達(dá)水平均符合正態(tài)分布，以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCs的形態(tài)表現(xiàn)NSCs 在體外懸浮培養(yǎng)時(shí)，由于NSCs 增殖會(huì)形成神經(jīng)球，從乳鼠下丘腦和海馬中提取的細(xì)胞在體外懸浮培養(yǎng)5 d 后，在顯微鏡下可觀察到球狀的細(xì)胞團(tuán)，即為NSCs 形成的神經(jīng)球，顯微鏡下下丘腦組織中NSCs 和海馬組織中NSCs 形成的神經(jīng)球不透明， 具有較高的折光率，球的邊緣有微絲，表明神經(jīng)球具有較好的狀態(tài)。見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠來(lái)源的P0 代下丘腦和海馬組織中NSCs 形態(tài)表現(xiàn)（Bar=200 μm）Fig.1 Morphology of mouse-derived P0 generation NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues（Bar=200 μm）

2.2 NSCs的鑒定P2 代下丘腦神經(jīng)球和海馬神經(jīng)球均呈現(xiàn)Nestin 表達(dá)陽(yáng)性和Sox2 陽(yáng)性，表明懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球?yàn)镹SCs。見(jiàn)圖2 （插頁(yè)二）。

2.3傳代培養(yǎng)后下丘腦和海馬組織中NSCs的純化率P2～P4 代下丘腦和海馬組織中NSCs 中Nestin 和Sox2 的陽(yáng)性表達(dá)率隨著代數(shù)的增加而增加，但下丘腦和海馬組織NSCs 中Nestin 和Sox2 的表達(dá)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)傳代培養(yǎng)到P2 代，下丘腦組織NSCs 中Sox2 陽(yáng)性 表 達(dá) 率 為（76.87±5.65） % （Sox2+/DPAI），海馬組織NSCs 中Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率為（80.75±10.76） %； 下丘腦組織NSCs 中Nestin 陽(yáng)性表達(dá)率 為（74.66±9.40） % （Nestin+/DPAI）， 海 馬組織NSCs 中Nestin 陽(yáng)性表達(dá)率為（80.72±12.71） %，見(jiàn)圖3。當(dāng)傳代培養(yǎng)到P4 代，下丘腦組織NSCs 中Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率為（98.35±2.58） %， 海馬組織NSCs 中Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率為（99.48±1.06） %；下丘腦組織NSCs 中Nestin 陽(yáng)性表達(dá)率為（98.73±1.81） %， 海馬組織NSCs中Nestin 陽(yáng)性表達(dá)率為（99.48±1.06） %，見(jiàn)圖4（插頁(yè)三） 和圖5，即傳代培養(yǎng)可以提升下丘腦和海馬組織NSCs 的純化率，因此，本課題組選擇具有較高純度的P4 代下丘腦和海馬組織的NSCs 用于后續(xù)研究，較高的NSCs 比例為蛋白質(zhì)組學(xué)的分析提供了保證。

圖3 下丘腦和海馬組織P2～P4 代NSCs 中的Nesin 和Sox2陽(yáng)性表達(dá)率Fig.3 Positive expression rates of Nesin and Sox2 in P2－P4 NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues

2.4下丘腦和海馬組織中NSCs質(zhì)譜分析通過(guò)TMT 標(biāo)記聯(lián)合LC-MS/MS分析共匹配到131 016個(gè)質(zhì)譜圖，鑒定到42 456 個(gè)肽段，38 195 個(gè)特異性肽段和5 593 種蛋白，對(duì)鑒定到的蛋白質(zhì)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示：在下丘腦和海馬組織NSCs 中最終得到10 種差異蛋白，其中相對(duì)于海馬NSCs 上調(diào)的蛋白有6 種， 相對(duì)于海馬NSCs 下調(diào)的蛋白有4 種。見(jiàn)表1。

圖5 P4 代下丘腦和海馬組織NSCs 中Nestin 和Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率Fig.5 Positive expression rates of Nestin and Sox2 of P4 generation NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues

2.5差異蛋白質(zhì)的GO和KEEG通路分析GO 功能富集分析結(jié)果表明：下丘腦組織NSCs 在某些生物 過(guò) 程（Biological processes， BP）、分 子 功 能（molecular functions， MF） 和細(xì)胞組分（cellular components，CC） 方面與海馬組織NSCs 存在明顯差異。其中，存在差異的BP 有響應(yīng)銅離子、參與突觸傳遞中多巴胺攝取的負(fù)調(diào)控、去甲腎上腺素?cái)z取的負(fù)調(diào)控、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的正調(diào)控、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性的調(diào)節(jié)和兒茶酚胺攝取的負(fù)調(diào)控等；存在差異的MF 包括銅離子結(jié)合、γ 谷酰 基 羧 化 酶 活 性、 β -1， 3- 半 乳 糖-0- 糖 基- 糖 蛋白β -1，3-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶活性、花生四烯酸的結(jié)合、二十醛的結(jié)合和rRNA 甲基轉(zhuǎn)移酶活性；存在差異的CC 有高爾基體膜、血小板顆粒膜和核內(nèi)膜-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜網(wǎng)絡(luò)等方面， 見(jiàn)圖6A （插頁(yè)三）。KEGG 通路富集分析結(jié)果表明：與海馬組織NSCs 中比較，下丘腦組織NSCs 在可溶性N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感性因子附著蛋白受體（SNARE）相關(guān)囊泡運(yùn)動(dòng)、腎素分泌、甘露糖型0-糖基生物合成、先天免疫缺陷、泛醌和其他萜烯類醌的生物合成、礦物質(zhì)吸收和皮質(zhì)醇合成與分泌通路上發(fā)生明顯變化，見(jiàn)圖6B （插頁(yè)三）。

3 討 論

NSCs 具有多向分化潛能、較低的免疫源性和較好的組織融合性，因此在針對(duì)神經(jīng)退行性疾病如帕金森病及阿爾茲海默病等的治療中，NSCs 移植治療受到關(guān)注［13-14］。針對(duì)NSCs 的研究集中于海馬的SGZ 和 側(cè) 腦 室 的SVZ［4］， 最 近 的 研 究［6，15］顯示：下丘腦同樣存在NSCs。下丘腦是機(jī)體代謝、內(nèi)分泌和心血管的調(diào)控中心，對(duì)于維持機(jī)體的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要作用［16］。 美國(guó)愛(ài)因斯坦醫(yī)學(xué)院的研究者［17］ 發(fā)現(xiàn)：下丘腦組織NSCs 可以延緩衰老，提示下丘腦組織NSCs 在治療衰老相關(guān)疾病中的潛在作用。下丘腦組織NSCs 和海馬組織NSCs 雖同為腦內(nèi)NSCs，但關(guān)于這2 種分布不同的NSCs 的功能差異尚無(wú)相關(guān)研究報(bào)道，因此本課題組通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)下丘腦組織NSCs 和海馬組織NSCs 進(jìn)行蛋白表達(dá)的分析。

表1 下丘腦和海馬組織NSCs 中蛋白變化情況Tab.1 Changes of proteins in NSCs in hypothalamic and hippocampal tissues

Nestin 在胚胎發(fā)育早期大量表達(dá)于神經(jīng)上皮干細(xì)胞中，但在成熟的神經(jīng)細(xì)胞中并不表達(dá)，因此常被用于鑒定NSCs［18］。研究［4］表明：Sox2 陽(yáng)性細(xì)胞可以進(jìn)行自我更新，單個(gè)Sox2 陽(yáng)性細(xì)胞可以分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。本研究將Nestin 和Sox2作為篩選NSCs 的標(biāo)志物，并通過(guò)Nestin 和Sox2 陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)比體外培養(yǎng)下丘腦組織NSCs 和海馬組織NSCs 的差異，結(jié)果表明對(duì)下丘腦組織NSCs 和海馬組織NSCs 進(jìn)行傳代培養(yǎng)可以增加NSCs 的純度，但下丘腦組織NSCs 和海馬組織NSCs 在傳代培養(yǎng)過(guò)程中的純度比較差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明下丘腦組織NSCs 和海馬組織NSCs 在相同培養(yǎng)體系下表現(xiàn)出相似的增殖和分化特性。

本文作者共發(fā)現(xiàn)10 種蛋白出現(xiàn)了變化， 其中6 種蛋白在下丘腦組織NSCs 中表達(dá)上調(diào)，4 種蛋白在下丘腦NSCs 中表達(dá)下降，通過(guò)生物信息學(xué)GO 功能分析和KEGG 通路注釋發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要在突觸傳遞及代謝等方面發(fā)揮作用。進(jìn)一步對(duì)蛋白的研究顯示：許多蛋白在維持細(xì)胞功能發(fā)面發(fā)揮重要作用， 如視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤樣蛋白2（retinoblastoma-like protein 2，P130），其具有抑制E2F 轉(zhuǎn)錄激活因子的功能，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元死亡和存活中起關(guān)鍵作用［19］。主要表達(dá)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的突觸融合蛋白18 （Syntaxin-18），參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間的轉(zhuǎn)運(yùn)［20］。Syntaxin-18 基因敲除可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)的變化，造成平滑內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的分離［21］，表明Syntaxin-18 在細(xì)胞生成的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)中不可或缺，但關(guān)于這些蛋白具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究體外培養(yǎng)小鼠原代下丘腦和海馬組織NSCs，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定了不同來(lái)源NSCs 在蛋白質(zhì)表達(dá)方面的差異，這些差異蛋白對(duì)于研究不同類型NSCs 的特性、下丘腦和海馬組織NSCs 移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義。