湯興宇 扈麟 吳中琴 周明璽 鐘嬡嬡 王鈺雯 廖奕揚(yáng) 田星 王遠(yuǎn)亮

摘 要：肉及其副產(chǎn)物中含有多種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)經(jīng)過酶解、微生物發(fā)酵或胃腸道消化后，產(chǎn)生多種有益于人體的活性肽，如降血壓肽（血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制肽）、抗氧化肽、抗菌肽和二肽基肽酶抑制肽等。肽的生物活性逐漸被人們重視，但其提取和篩選仍然受到分離鑒定技術(shù)的限制。計(jì)算機(jī)分析技術(shù)能夠很好地評(píng)估及分離鑒定蛋白質(zhì)作為活性肽前體蛋白的能力，模擬酶及化學(xué)作用對(duì)蛋白質(zhì)的水解，預(yù)測(cè)肽序列的活性及其化學(xué)性質(zhì)。本文對(duì)肉源性活性肽進(jìn)行綜述，并介紹計(jì)算機(jī)分析技術(shù)在分離鑒定活性肽中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：肉源性活性肽;蛋白質(zhì);酶解;計(jì)算機(jī)分析技術(shù)

Abstract： Meat and meat processing by-products contain a variety of proteins， which can be used to produce various bioactive peptides that are beneficial to the human body after enzymatic hydrolysis， microbial fermentation or gastrointestinal digestion， such as antihypertensive peptide （angiotensin converting enzyme inhibitory peptide）， antioxidant peptide， antibacterial peptide， and dipeptidyl peptidase Ⅳ inhibitory peptide. Although increasing attention has been paid to the bioactivities of peptides， extraction and screening of peptides are still limited by the existing purification and identification techniques. In silico analysis can characterize the potential of proteins as precursors of bioactive peptides， simulate proteolysis catalyzed by enzymatic or chemical action， and predict the activity of peptide sequences and their chemical properties. In this paper， bioactive peptides derived from meat proteins are reviewed， as well as the application of in silico analytical techniques in the separation and identification of bioactive peptides.

Keywords： bioactive peptide derived from meat; protein; enzymolysis; in silico analysis

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200720-173

中圖分類號(hào)：TS201.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）09-0088-08

引文格式：

湯興宇， 扈麟， 吳中琴， 等. 肉源性活性肽及其計(jì)算機(jī)分析技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 肉類研究， 2020， 34（9）： 88-95. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200720-173. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

TANG Xingyu， HU Lin， WU Zhongqin， et al. Recent progress in meat-derived bioactive peptides and In silico analytical techniques for them[J]. Meat Research， 2020， 34（9）： 88-95. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200720-173. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

肉是人類攝取蛋白質(zhì)的主要來源之一，新鮮肉中的蛋白質(zhì)主要包括肌纖維蛋白和肌漿蛋白兩大類。剛屠宰后胴體中許多肽酶仍然具有活性，這些肽酶能夠促進(jìn)肌漿蛋白和肌纖維蛋白的水解以及肽的釋放，尤其是內(nèi)肽酶與外肽酶[1]。活性肽在蛋白質(zhì)水解過程中從前體蛋白中釋放，它是一類能調(diào)節(jié)生理功能的氨基酸序列，能在體內(nèi)與特定受體結(jié)合，發(fā)揮生物學(xué)活性。已有許多研究證明，肉源性生物活性肽具有良好的功能特性，如降血壓、抗氧化和抗菌等。不同來源的肉或肉制品水解的蛋白質(zhì)和釋放的肽也存在差異[2]。Escuder等[3]研究表明，與肌漿蛋白（3 534 個(gè)肽序列）相比，肌原纖維蛋白可產(chǎn)生更豐富的生物活性肽（6 330 個(gè)肽序列）。通過蛋白質(zhì)的水解模式和肽的產(chǎn)生可以區(qū)分不同種類的肉制品。例如，與薩拉米香腸相比，福特香腸中肌動(dòng)蛋白水解更為顯著，來源于肌動(dòng)蛋白的肽數(shù)量也最多，而薩拉米香腸中產(chǎn)生的肽則主要來源于肌紅蛋白、M型肌酸激酶和L-乳酸脫氫酶[4]。

在肉制品工業(yè)中，加工后剩余的血液、骨頭、皮膚、角、臟器等副產(chǎn)物往往會(huì)被制成動(dòng)物飼料、肥料、食品添加劑和生物燃料等[5]，利用率較低。這些“邊角料”中富含蛋白質(zhì)，并且是活性肽的良好來源。骨頭中膠原蛋白占骨蛋白的90%[6];Wang Xueqi等[7]從羊骨中制備鈣螯合肽;魚皮中也含有豐富的膠原蛋白，尹劍等[8]從鱘魚魚皮膠原蛋白中制備抗氧化肽，優(yōu)化酶解工藝后產(chǎn)生的抗氧化肽能顯著增加總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶的活性;Lee等[9]的研究結(jié)果證明亞臨界水解魚皮膠原蛋白肽具有降脂效果;血液中富含血紅蛋白和纖維蛋白，Yang Jing等[10]從鴨血中分離出7 種抗氧化肽，Adje等[11]在牛血紅蛋白水解液中分離出27 種抗菌肽。本文對(duì)近年來肉源性活性肽的制備方法和功能進(jìn)行綜述，并簡(jiǎn)單總結(jié)了計(jì)算機(jī)技術(shù)在活性肽發(fā)掘中的應(yīng)用。

1 肉源性活性肽的制備方法

肉類蛋白質(zhì)中含有許多活性片段，只有在合適的條件下才能從前體蛋白中釋放[12]。在肉制品加工過程中，肉類蛋白質(zhì)在內(nèi)源酶和外源酶的作用下會(huì)產(chǎn)生許多肽段，這些肽段中只有一部分肽序列具有生物活性。生物活性肽若要在食用后仍能發(fā)揮其生理作用，需要活性肽在進(jìn)入人體后的腸內(nèi)運(yùn)輸過程中保持其完整性，且不被消化道中的酶水解，才能夠穿過腸膜并完整地進(jìn)入血液。目前的研究中，常使用酶解法、微生物發(fā)酵法以及模擬胃腸道消化法水解肉類蛋白質(zhì)，制備肉源性活性肽。

1.1 酶解法

制備生物活性肽最常用的方法是使用動(dòng)物、植物或微生物來源的商業(yè)肽酶水解蛋白質(zhì)。通常用于蛋白質(zhì)水解的肽酶主要有木瓜蛋白酶、熱溶血素、堿性磷酸酶、中性酶、黃曲酶或放線酶E等，每種酶的切割位點(diǎn)都不相同，如胰蛋白酶優(yōu)先切割精氨酸或賴氨酸后的肽鍵，糜蛋白酶切割酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸或亮氨酸的羧基形成的肽鍵等[13]。選擇合適的酶切割對(duì)肽的釋放具有重要的作用。Wu Hao等[14]使用蛋白酶SM98011消化鯊魚肉獲取血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽;Kim等[15]使用6 種不同的蛋白酶對(duì)鹿肉進(jìn)行酶解，其中木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)物的抗氧化活性最高。在大多數(shù)研究中常常將2 種以上的酶結(jié)合使用，從而提高活性肽的產(chǎn)率[16]。Kang Le等[17]使用復(fù)合蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶制備牛肉水解液，并將水解液純化后鑒定其中的風(fēng)味前體肽。酶解法在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些不足，如酶的成本高昂、回收利用率低以及酶解條件要求高等，但在現(xiàn)有技術(shù)條件下，利用固定化酶的方法可以提高酶的回收利用率[18]。楊小翠[19]利用納米磺化聚苯乙烯微球固定枯草芽孢桿菌蛋白酶酶解羅非魚魚皮膠原蛋白，在重復(fù)使用5 次固定化酶后，酶相對(duì)活性仍然可保留68.7%，與僅只能使用1 次的商業(yè)酶相比，極大節(jié)約了成本。

1.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是在肉自身內(nèi)源酶與微生物的聯(lián)合作用下豐富發(fā)酵產(chǎn)物中的肽種類。許多微生物能產(chǎn)生外切肽酶，其可以減少苦味肽的產(chǎn)生[20]。微生物發(fā)酵法還具有微生物來源廣、繁殖快、成本低和蛋白酶產(chǎn)量高的優(yōu)點(diǎn)。Jemil等[21]使用莫哈文芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）A21發(fā)酵斑馬魚獲取抗菌肽。Ohata等[22]用酒曲作為發(fā)酵劑制備發(fā)酵酸肉，并鑒定出具有抗氧化活性的三肽。已有許多活性肽在一些傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中被發(fā)現(xiàn)，并在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證其功能活性，如我國(guó)宣威火腿和金華火腿中存在許多抗氧化肽和ACE抑制肽[23-25]。然而，微生物發(fā)酵法周期長(zhǎng)，發(fā)酵酶系復(fù)雜，并且一些微生物的安全性仍然存在爭(zhēng)議，這也意味著需要在前期準(zhǔn)備中耗費(fèi)大量時(shí)間篩選合適的微生物。de Almeida等[26]使用4 種常見的乳桿菌作為發(fā)酵劑發(fā)酵低鹽香腸，比較不同菌種和發(fā)酵時(shí)間下肽的釋放規(guī)律，發(fā)現(xiàn)彎曲乳桿菌（Lactobacillus curvatus）發(fā)酵的低鹽香腸中產(chǎn)生的低分子質(zhì)量肽最多。還有許多研究將發(fā)酵法與酶解法結(jié)合使用以豐富肉制品中的活性肽[8]。

1.3 模擬胃腸道消化法

胃腸道消化法常用于研究蛋白質(zhì)在胃腸液中經(jīng)過消化酶水解后產(chǎn)生的生物活性肽。由于參與胃腸道消化過程中的酶可能會(huì)對(duì)攝入的肽產(chǎn)生酶解修飾作用，導(dǎo)致一些在體外具有生物活性的肽在體內(nèi)無法表現(xiàn)出其活性，因此該方法還被用于評(píng)估活性肽的生物利用度。

在研究中常用到的消化酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶[27-28]。Jiang Shui等[29]模擬了胃液的酸性環(huán)境，先使用胃蛋白酶對(duì)4 種中國(guó)干腌火腿進(jìn)行模擬消化，改變pH值使胃蛋白酶失活，再加入胰蛋白酶消化，以獲得不同干腌火腿的蛋白質(zhì)譜圖和肽譜。Gallego等[30]在酸性環(huán)境中添加胃蛋白酶對(duì)干腌火腿進(jìn)行胃液消化，再通過改變pH值并加入胰蛋白酶、糜蛋白酶和胰脂肪酶模擬腸液環(huán)境消化，最終在消化后產(chǎn)物中鑒定得到抗氧化肽。此外，還可以使用活體進(jìn)行胃腸道消化，Sayd等[31]在小型豬胃體大彎長(zhǎng)軸中間處安裝一個(gè)永久性插管，在小型豬攝入熟制牛肉后，每5 h收集消化液，研究結(jié)果揭示了體內(nèi)胃消化過程中肽釋放的動(dòng)力學(xué)。

2 肉源性活性肽的分類及功能

2.1 ACE抑制肽

高血壓已成為一個(gè)日益嚴(yán)重的健康問題，影響到全球1/3的成年群體，尤其是發(fā)達(dá)國(guó)家[32]。ACE能夠催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)變成致使血管收縮的血管緊張素Ⅱ，同時(shí)使血管舒張作用的緩激肽失活，從而導(dǎo)致血壓升高[33]。因此，抑制ACE的活性能夠減少血管緊張素Ⅱ的產(chǎn)生，提高緩激肽濃度，從而能夠有效降低血壓并且預(yù)防和治療高血壓及其相關(guān)疾病[34]。目前，市場(chǎng)上已存在許多抑制ACE酶活性的降血壓藥物，如普利類降壓藥。ACE抑制肽C末端氨基酸與ACE抑制活性密切相關(guān)，當(dāng)末端氨基酸為色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸這些疏水性氨基酸時(shí)，ACE抑制活性更高。

目前，通常采用體外ACE抑制活性進(jìn)行肽的降壓活性評(píng)價(jià)。ACE在體內(nèi)會(huì)特異性地切割肽C末端的2 個(gè)氨基酸，選用含有馬尿酸的三肽如HHL作為底物，加入ACE與ACE抑制劑反應(yīng)后，通過測(cè)定馬尿酸含量可以獲得樣品的ACE抑制率[35]。但體外ACE抑制活性的評(píng)價(jià)結(jié)果還需通過體內(nèi)抑制活性進(jìn)一步驗(yàn)證，這是由于這些肽可能在胃腸道消化過程中被水解，從而使其抑制活性降低。

Mora等[36]在伊比利亞干腌火腿的研究中發(fā)現(xiàn)，3 種重復(fù)次數(shù)最多的氨基酸序列（PPK、PAP與AAP）具有較高的ACE抑制活性。Martini等[37]研究發(fā)現(xiàn)，豬肉、牛肉、雞肉和火雞肉分別經(jīng)過胃腸道消化后，所有肉類消化物中均檢測(cè)到ACE抑制活性肽，其中，雞肉消化物的ACE抑制活性最高，且ACE抑制肽種類也最多，達(dá)到24 種。Saeed等[38]對(duì)肉類副產(chǎn)物心、腎和肝進(jìn)行酶解，考察不同樣品酶解產(chǎn)物的ACE抑制率隨酶解時(shí)間的變化，結(jié)果表明，酶解時(shí)間與ACE抑制活性呈正相關(guān)，其中肝酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性最高。

2.2 抗氧化肽

根據(jù)所涉及的化學(xué)反應(yīng)，肽的抗氧化活性主要以2 種方式體現(xiàn)：一種是在競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)中通過供氫以減少自由基的產(chǎn)生，評(píng)價(jià)方法包括氧自由基吸收能力測(cè)定（oxygen radical absorbance capacity assay，ORAC）、總自由基捕集抗氧化參數(shù)和β-胡蘿卜素漂白實(shí)驗(yàn);另一種是轉(zhuǎn)移電子以減少氧化劑，評(píng)價(jià)方法包括2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）陽(yáng)離子自由基、1，1-二苯基-2-吡啶肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除實(shí)驗(yàn)以及鐵離子還原抗氧化能力測(cè)定?？寡趸拇蠖嗪?～16 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為400～2000 Da[39]。已有研究證明，肽的抗氧化特性與肽的組成、結(jié)構(gòu)和疏水性有密切關(guān)系。當(dāng)肽序列中含有酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸時(shí)，肽鏈表現(xiàn)出自由基清除活性，且這些氨基酸在肽鏈中的重復(fù)次數(shù)和排列方式均會(huì)對(duì)肽鏈的抗氧化性產(chǎn)生顯著影響[40]。

我國(guó)宣威火腿、金華火腿和羊肉火腿[41]以及西班牙干腌火腿中均已鑒定出多種抗氧化肽。與宣威火腿中抗氧化肽DLEE（74.45%）相比，金華火腿中抗氧化肽GKFNV的DPPH自由基清除率達(dá)到90.31%，抗氧化能力更高[23-24]。Gallego等[42-43]在西班牙干腌火腿中分離鑒定出2 種抗氧化肽SNAAC與AEEEYPDL，其ORAC分別為3 097.04 nmol/mg和960.04 nmol/mg（以α-生育酚當(dāng)量計(jì)算），ABTS陽(yáng)離子自由基清除能力分別為2 737.4 nmol/mg和1 474.08 nmol/mg，表明肽SNAAC的抗氧化性更好。一些副產(chǎn)物中也含有許多抗氧化肽。如雞冠經(jīng)堿性磷酸酶水解后可得到2 種抗氧化肽GADGAP和GKDGCR;鴨血漿經(jīng)堿性蛋白酶酶解后分離鑒定出7 種抗氧化肽LDGP、TGVGTK、EVGK、RCLQ、LHDVK、KLGA以及AGGVPAG，其中EVGK的Fe2+螯合能力最強(qiáng)[10]。

2.3 抗菌肽

近年來，由于抗生素的濫用導(dǎo)致許多細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性，甚至出現(xiàn)超級(jí)細(xì)菌[45-46]。由于抗菌譜廣、且不會(huì)使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，抗菌肽引起了人們的關(guān)注。抗菌肽的抗菌活性因肽長(zhǎng)度、電荷、疏水性、氨基酸組成和二級(jí)結(jié)構(gòu)的不同而不同[47]。Powers等[48]在揭示抗菌肽結(jié)構(gòu)-活性關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn)，具有抗菌活性的肽需要具備陽(yáng)離子電荷和誘導(dǎo)雙親構(gòu)象2 個(gè)基本要求。Castellano等[49]從西班牙干腌火腿中篩選具有抗單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）的多肽，合成活性組分中的12 個(gè)肽并驗(yàn)證其抗菌性，發(fā)現(xiàn)共有10 個(gè)肽具有抑制單核細(xì)胞李斯特菌活性，其中抑菌肽RHGYM的抑菌活性最高，其最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）為6.25 mmol/L。從鴨中鑒定得到的一種新型抗菌肽dCATH具有146 個(gè)氨基酸，其可通過增加細(xì)胞膜通透性破壞微生物細(xì)胞膜的完整性，從而殺死微生物。大量研究證明，血紅蛋白對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌具有廣譜抗菌活性，一些已被發(fā)現(xiàn)的抗菌肽也往往來源于血紅蛋白。Yang Shen等[51]利用生物信息學(xué)技術(shù)從大黃魚血紅蛋白中鑒定出一種新型抗菌肽LCH4，其肽序列為AWQKFLSAVVSALGR，LCH4對(duì)金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）均有抑制作用，并能通過穿透細(xì)菌的細(xì)胞壁殺死細(xì)菌，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物外泄和細(xì)胞膜崩塌。Adje等[11]從牛血紅蛋白水解液中分離出26 種抗菌肽，均能抑制黃體微球菌（Micrococcus luteus）A270、無害李斯特菌（Listeria innocua）和大腸桿菌（Escherichia coli）的生長(zhǎng)，MIC為1.0～187.1 μmol/L，肽TSKYR對(duì)無害李斯特菌的MIC最低，僅為1 μmol/L。

2.4 DPP-Ⅳ抑制肽

糖尿病主要包括Ⅰ型糖尿病和2型糖尿病，其中Ⅱ型糖尿病的患者高達(dá)90%以上，Ⅱ型糖尿病的病因主要與機(jī)體調(diào)節(jié)血糖能力相關(guān)。二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）是一種與血糖調(diào)節(jié)相關(guān)的酶，能降解胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）。GLP-1與葡萄糖依賴性胰島素樣肽（glucose-dependent insulinotropic peptide，GIP）都屬于腸促胰島素，行使促胰島素分泌的功能，在食物進(jìn)入人體后被釋放，以維持人體餐后血糖水平。GLP-1經(jīng)DPP-Ⅳ降解后，活性喪失，削弱了其降血糖效果[52]。市售降糖藥中，磷酸西格列汀、沙格列汀、利格列汀和維格列汀等均是通過抑制DPP-Ⅳ活性降低血糖。

目前，許多肉源性活性肽被證明具有抑制DPP-Ⅳ效果，并且相比雞肉、牛肉而言，豬肉是DPP-Ⅳ抑制肽的重要來源。Martini等[37]對(duì)雞肉、牛肉和豬肉進(jìn)行模擬胃腸道消化，從豬肉模擬胃腸道消化物中鑒定出DPP-Ⅳ抑制肽的種類最多;Lafarga等[53]也通過計(jì)算機(jī)技術(shù)得出相同結(jié)論，即與牛肉蛋白相比，DPP-Ⅳ抑制肽更多來源于豬肉。Haredy-Rothwell等[54]在方鯛蛋白水解液中發(fā)現(xiàn)的肽IPVDM具有強(qiáng)烈的DPP-Ⅳ抑制活性，IC50達(dá)到21.72 μmol/L。Jin Ritian等[55]酶解三文魚魚皮膠原蛋白后，從胰蛋白酶酶解產(chǎn)物中鑒定出DPP-Ⅳ抑制肽LDKVFR，體外抑制DPP-Ⅳ的IC50為0.1 mg/mL。Gallego等[56]從西班牙干腌火腿中發(fā)現(xiàn)9 種肽對(duì)DPP-Ⅳ均具有抑制作用，其中抑制作用最強(qiáng)的肽KA和AAATP的IC50分別為6.27 mmol/L和6.47 mmol/L。

2.5 其他活性肽

除上述活性肽以外，從肉中還鑒定出抗炎肽、阿片肽和α-葡萄糖苷酶抑制肽等?？寡纂目梢哉{(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，刺激巨噬細(xì)胞活性，抗炎肽在肉品中常見于魚肉及其副產(chǎn)物。采用胃蛋白酶酶解鱘魚蛋白產(chǎn)生的肽KIWHHTF、VHYAGTVDY以及HLDDALRGQE能夠提高脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7中SOD活性，降低炎癥細(xì)胞因子的釋放[57]。Durand等[58]從鯡魚魚糜中分離出2 種新型抗炎肽IVPAS和FDKPVSPLL，能抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生一氧化氮，在質(zhì)量濃度1 ng/mL時(shí)抑制率分別為11.8%和12.0%。阿片肽對(duì)人體內(nèi)阿片類受體具有良好的親和力，與阿片類受體結(jié)合后，在體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)調(diào)節(jié)劑的作用，這種作用具有兩面性，能干預(yù)痛覺，改變情緒以及影響行為反應(yīng)等[59]。Piot等[60]在牛血紅蛋白消化物中鑒定出2 種阿片肽VVYPWTQRF和LVVWPWTQRF。最近的研究中，Mora等[61]在伊比利亞干腌香腸中發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶抑制肽，其能有效延緩碳水化合物的消化，減少碳水化合物對(duì)血糖水平的影響，并降低高血糖。在已鑒定出的α-葡萄糖苷酶抑制肽中，有8 種肽還具有其他生物活性，如在西班牙干腌火腿中發(fā)現(xiàn)的肽AEEEYPDL，不僅具有α-葡萄糖苷酶抑制活性還具有抗氧化活性[43]。

已有許多研究證明肽可以同時(shí)具備多種生物活性，如Tyr-Pro-D-Ala-NH2既具有抗炎性，還具有DPP-Ⅳ抑制活性[62]。從雞肉中鑒定出的ACE抑制肽IWHHT能顯著降低腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中血管細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)，表現(xiàn)出抗炎作用[63]。

3 計(jì)算機(jī)分析技術(shù)在肉源活性肽中的應(yīng)用

近些年，關(guān)于活性肽的研究越來越多，但是在研究過程中對(duì)活性肽的分離鑒定仍然存在困難，分離活性肽消耗周期長(zhǎng)，需要使用的大型精密儀器多。在分離鑒定過程中常使用到超濾、葡聚糖凝膠分離、陰離子交換、尺寸排阻色譜和反相高效液相色譜等技術(shù)對(duì)活性肽進(jìn)行分離純化，再通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜鑒定肽序列。

隨著生物信息學(xué)技術(shù)逐漸普及和應(yīng)用，活性肽的發(fā)掘形成新的方向，利用計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)或肽進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。根據(jù)功能可以將其劃分為4 類：對(duì)某種蛋白質(zhì)作為活性肽來源的效能評(píng)價(jià)、預(yù)測(cè)不同條件下蛋白質(zhì)水解后產(chǎn)生的肽、肽序列的生物活性分析和肽序列的化學(xué)性質(zhì)分析。常用的活性肽分析工具包括BIOPEP、Peptide Ranker、Peptide Cutter和ExPASy computer PI/MW Tool等，具體功能見表5。

3.1 蛋白質(zhì)的效能評(píng)價(jià)

許多研究者借助計(jì)算機(jī)分析技術(shù)對(duì)肉源性活性肽進(jìn)行效能評(píng)價(jià)，以評(píng)估某一蛋白質(zhì)中潛在的活性肽序列含量，判斷該蛋白質(zhì)是否能作為目標(biāo)活性肽的來源。在開展這一工作前需要獲取該蛋白質(zhì)的一些基本信息，常用的工具有UniPort、NCBI Protein Database和BIOPEP。對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行效能評(píng)價(jià)時(shí)，一般使用BIOPEP中的Profiles of Potential Biological Activity對(duì)蛋白質(zhì)中的生物活性肽進(jìn)行分析，獲得潛在生物活性，通過計(jì)算基于蛋白質(zhì)鏈中生物活性片段的出現(xiàn)概率和蛋白質(zhì)中某活性肽的潛在活性，以衡量蛋白質(zhì)作為生物活性肽潛在前體的價(jià)值[64]。Keska等[65]對(duì)豬骨骼肌中的16 種蛋白質(zhì)進(jìn)行效能評(píng)價(jià)，研究這些蛋白作為DPP-Ⅳ抑制肽以及葡萄糖攝取刺激肽來源的可行性，發(fā)現(xiàn)肌聯(lián)蛋白和肌漿蛋白是DPP-Ⅳ抑制肽的最佳前體蛋白。

3.2 模擬酶及化學(xué)作用水解

模擬酶水解是活性肽研究中的熱門方法。每種酶均會(huì)有其固定的切割位點(diǎn)，在不考慮任何化學(xué)修飾及其他因素影響的情況下，通過對(duì)蛋白質(zhì)可能的產(chǎn)物進(jìn)行分析，從而篩選出有利于目標(biāo)產(chǎn)物生產(chǎn)的酶或酶組合。BIOPEP中的Enzyme（s） Action以及Peptide Cutter模塊常被用于模擬蛋白質(zhì)酶解，以獲得酶解后蛋白質(zhì)產(chǎn)生的肽序列及在前體蛋白中的位置。BIOPEP在獲得模擬水解產(chǎn)物后，能進(jìn)一步尋找產(chǎn)物中的活性肽或計(jì)算表征蛋白水解的定量參數(shù)。Peptide Cutter還能模擬蛋白質(zhì)化學(xué)處理后的斷裂位點(diǎn)。Lafarga等[66]利用Peptide Cutter模擬豬肉和牛肉源蛋白質(zhì)在熱溶血素和胃蛋白酶作用下的水解，再通過BIOPEP預(yù)測(cè)無花果蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶酶解產(chǎn)生的ACE-Ⅰ、腎素和DPP-Ⅳ抑制肽的分布，發(fā)現(xiàn)豬肉源蛋白質(zhì)中含有大量的潛在DPP-Ⅳ抑制肽。同樣，K?ska等[13]對(duì)篩選出的8 種豬纖維蛋白進(jìn)行計(jì)算機(jī)分析，用BIOPEP模擬胃腸道消化后胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解產(chǎn)生的活性肽，結(jié)果表明，DPP-Ⅳ抑制肽序列出現(xiàn)的頻率最高，肌動(dòng)蛋白、伴肌動(dòng)蛋白和肌聯(lián)蛋白中產(chǎn)生的活性肽片段最多。

3.3 肽序列活性的預(yù)測(cè)及化學(xué)性質(zhì)分析

對(duì)肽序列的活性分析能提高生物資源的利用度。Peptide Ranker分析肽活性的方式是對(duì)輸入的不同肽序列可能有活性的概率進(jìn)行評(píng)分，并根據(jù)分?jǐn)?shù)的高低從“0”到“1”排序。但這個(gè)評(píng)分并不是指肽的活性能力強(qiáng)弱，而是存在活性的概率[67]。BIOPEP中有全面的生物活性肽數(shù)據(jù)庫(kù)，除BIOPEP外，還有很多單一功能的肽序列庫(kù)，如降血壓肽數(shù)據(jù)庫(kù)（AHTPDB）、抗菌肽數(shù)據(jù)庫(kù)（APD）和抗癌蛋白肽數(shù)據(jù)庫(kù)（CancerPPD）等。還有許多預(yù)測(cè)肽序列化學(xué)性質(zhì)的工具，如ExPASy computer PI/MW Tool，具有分析理論分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)值、疏水性以及繪制肽的理論結(jié)構(gòu)圖等功能。此外，還有預(yù)測(cè)肽序列是否具有致敏性[68]和毒性[69]的工具。

計(jì)算機(jī)分析技術(shù)為生物活性肽的發(fā)現(xiàn)和鑒定提供了新的思路。利用計(jì)算機(jī)分析技術(shù)，獲取蛋白質(zhì)氨基酸序列后，通過對(duì)其作為活性肽的前體蛋白進(jìn)行效能評(píng)價(jià)，再對(duì)需要研究的蛋白質(zhì)模擬酶解，分析不同酶作用下產(chǎn)生的活性肽差異，從而為實(shí)驗(yàn)提供研究方向。此外，通過鑒定的肽序列，還可以預(yù)測(cè)其生物活性、化學(xué)性質(zhì)和理論結(jié)構(gòu)圖，辨別肽的生物安全性。

4 結(jié) 語(yǔ)

目前關(guān)于生物活性肽的研究日趨豐富，研究人員已從鮮肉、肉制品和肉類副產(chǎn)物中分離鑒定出多種活性肽。但關(guān)于肉源性抗癌肽、降脂肽、刺激肽、螯合肽的相關(guān)研究不足，可能與原料肉處理和分離提純技術(shù)有關(guān)。目前，活性肽的應(yīng)用仍面臨著挑戰(zhàn)，肉品的粗肽溶液中肽的數(shù)量雖然較多，但有活性的肽濃度偏低，活性肽純化后純度也較低;在粗肽溶液中，肽之間存在協(xié)同和拮抗作用，單一肽可能不表現(xiàn)出活性;純品肽通常呈現(xiàn)出疏水性，易析出結(jié)晶;對(duì)活性肽的研究大部分停留在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，臨床實(shí)驗(yàn)不足;這些都是限制活性肽發(fā)展亟需改善和解決的問題。計(jì)算機(jī)分析技術(shù)的推廣促進(jìn)生物活性肽的發(fā)現(xiàn)，能為發(fā)掘肽的活性提供理論基礎(chǔ)，具有巨大的現(xiàn)實(shí)意義，也是未來研究活性肽的重要手段。

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